第十章亲和色谱

第十章亲和色谱生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性一、概述生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲和作用。具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔”的空间结构关系。亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合：静电作用氢键疏水相互作用配位键弱共价键1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、pH：在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其它pH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用影响亲和作用的因素4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进行分离的技术为亲和分离技术亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互作用的物质常见亲合作用体系特异性亲和体系高特异性抗原-单克隆抗体荷尔蒙－受体蛋白核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白酶－底物、产物、抑制剂群特异性免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白酶－辅酶凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质-肝素酶、蛋白质-活性色素（染料）酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）10找与底物专一可逆结合的配基；将配基通过共价键偶联到基质；配基与底物吸附；洗脱目标物。亲和层析过程11二、亲和纯化技术亲和层析(Affinitychromatography)亲和过滤（膜分离）亲和分配（双水相萃取）亲和反胶团萃取（反胶团萃取）亲和沉淀（沉淀）亲和电泳（电泳）配基生物特异性配基拟生物亲和配基亲和配基必须具备的条件：1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的2、结合常数要适当3、稳定性好，可进行化学改性专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度亲和配基的分类单专一性的小分子配基基团专一性的小分子亲和配基专一性的大分子亲和配基免疫亲和配基基团专一性的大分子亲和配基亲和配基的选择组合化学肽库选择亲和配基目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序列噬菌体展示技术目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克隆群体→氨基酸序列SELEX技术随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选亲和洗脱目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。亲和色谱亲和层析(AffinityChromatography，AC)是利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。是亲和分离技术中最具优势的方法含配体溶液收集目的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样品平衡液带有配体的树脂珠（或胶粒）亲和作用体系将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子（目标产物），使其从混合物中高选择性地分离纯化。一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基（ligand），用L表示。Kd解离常数Keq结合常数[E]、[L]和[E·L]分别表示蛋白质、配基和其复合体的平衡浓度。结合常数Keq越大，或解离常数Kd越小，表示亲和结合作用越强。Keq一般为104～108L/mol，有些最高可达到1015L/mol。低于103L/mol，亲和结合作用太小，不能有效结合目标。亲和层析的基本特点1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高；2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子；3、纯化倍数大，产物纯度高；4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件；5、价格相对较昂贵；6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。基质的选择理想的基质应符合下面的要求：1．极低的非特异性吸附2．高度的亲水性3．较好的理化稳定性亲和色谱介质的制备4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合5．适当的多孔性一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。配基的选择根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specificligand）通用性配体（generalligand）。特异性配体特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。通用性配体通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。32配基的浓度对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增加配基浓度有利于吸附。增加亲和柱的长度来提高吸附率。配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。理想的配基浓度为1-10μmol/L。33配基偶联的位置配基固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。34配基分子的大小选用大分子配基。小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。亲和吸附介质的配基（1）酶的抑制剂一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，能引起这类抑制作用的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较广，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。（2）抗体利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinitychromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。（3）蛋白A蛋白A（proteinA）为分子量约42KD的蛋白质，存在于黄色葡萄球菌的细胞壁中，占该细胞壁构成成分约5％。蛋白A在确定其为蛋白质之前称A抗原，与动物免疫球蛋白G(immunogloblinG，IgG)具有很强的亲和结合作用，结合部位IgG分子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部分）。蛋白A不与抗体（IgG）的抗原结合部位结合，而且任何抗体的Fc片断的结构都非常相似，因此蛋白A可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。（4）凝集素凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。例如，常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA，ConA)与葡聚糖和甘露糖的亲和结合作用较强，而麦芽糖凝集素（wheatgermagglutinin，WGA）与N-乙酰葡糖胺（N-acetyl-glucosamine）的亲和结合作用较强。（5）辅酶和磷酸酰苷各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和作用。辅酶主要有辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadeninedinucleotide，NAD）、辅酶Ⅱ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADphosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外，磷酸腺苷（adenosine5’-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine2’,5’-diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用，可用做这些酶的亲和配基。（6）色素配基三嗪类色素(triazinedyes)是一类分子内含有三嗪环的合成活性染料,与各种需要在NAD的存在下表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合作用。这类色素与NAD的结合部位相同,具有抑制酶活性的作用,因此又称为生物模拟色素(biomimeticdye)。利用色素为配基的亲和色谱法一般称作色素亲和色谱(dyeligandaffnitychromatography)。除脱氢酶和激酶外,三嗪类色素还与很多蛋白质具有结合能力,如血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶和糖解酶等,用途非常广泛。色素与这些蛋白质结合的作用机理很复杂,有些是疏水性相互作用,有些则是疏水性吸附和静电吸附共同作用的结果。CibacronBlue3GA(又称ReactiveBlue2)最常用的活性色素（7）过渡金属离子Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子（electrondonoratom）产生配位键，因此，可与蛋白质表面的组氨酸(His)的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+。过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用作亲和吸附蛋白质的配基。这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为金属螯合亲和色谱(metalchelateaffinitychromatography)或固定化金属离子亲和色谱(immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)。亚胺二乙酸（IDA）（8）组氨酸在各种氨基酸中，组氨酸的性质比较独特：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白质以及吸附蛋白的洗脱实验结果表明，静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。因此利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法。（9）肝素肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5～30KD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低。三、亲和吸附剂及其制备方法将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面(孔内)即可制备亲和吸附剂。该