紫外-可见分光光度分析的现状和展望

第10章紫外-可见分光光度分析的现状和展望目录一、引言二、紫外可见分光光度计各部件的发展三、紫外可见分光光度计的分类及特点四、试剂和反应的改进五、紫外可见分光光度技术与其他技术的联用一、引言紫外-可见分光光度法(Ultraviolet-VisibleSpectrophotometry，UV-VIS)是利用物质的分子或离子对波长在200～760nm范围内的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。从这项技术诞生至今，广大的科技工作者一直致力于对它的研究。紫外-可见分光光度法的特点：1、与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;2、灵敏度高;3、选择性好;4、精密度和准确度较高;二、紫外可见分光光度计各部件的发展紫外分光光度计的组成：光源单色器吸收池检测器显示2.1光源Tradition:卤素钨灯和氘灯Newest：发光二级管（LED）通常是钨卤素灯和氘灯两者组合使用。氙灯是新颖的光源，发光效率高、强度大，而且光谱范围宽，包括紫外、可见和近红外。随着发光二极管(LED)光源技术及产业的日益成熟，LED灯体积小，发光效率高，响应时间快，可控性大，所以以LED为光源的小型便携又低廉的分光光度计已成为研究开发的热点。2.2分光系统Tradition：单色仪分为扫描光栅型和固定光栅型，扫描光栅型的单色仪至于样品室之前，而固定光栅型的单色仪则至于样品室之后。Newest：双单色器进一步提高了分光光度计的分辨率并降低了杂散光，其降低杂散光的性能是单个单色器分光光度计无法企及的。单色器介绍：单色器是将光源辐射的复合光分成单色光的光学装置。它是分光光度计的心脏部分。单色器一般由狭缝、色散元件及透镜系统组成。关键是色散元件，最常见的色散元件是棱镜和光栅。棱镜:玻璃350～3200nm，石英185～4000nm。光栅:波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。543211.入射狭缝2.准直透镜3.棱镜4.聚焦棱镜5.出射狭缝2.3光栅-分光系统的核心元件Tradition:棱镜和机刻光栅由棱镜和机刻光栅组成的分光系统，杂散光一般较多，衍射率较高，且分辨率不是很高。Newest：全息光栅全息光栅组成的分光系统，杂散光极小；全息光栅的槽形通常近似正弦波形，没有明显的闪耀特性，故衍射效率较低；全息技术使光栅刻线总数大幅度增加，因此色散率和分辨率也大幅度得到提高。2.4检测器Tradition:光电倍增管在传统的分光光度计中应用广泛，光电倍增检测器在长波段灵敏度较差。Newest：阵列型光电检测器阵列型光电探测器的典型代表是光电二极管阵列检测器(PDA)和电荷耦合阵列检测器(CCD)，此类检测器测量速度快，多通道同时曝光，最短的时间是毫秒数量级，也可以累积光照，积分时间最长可达几十秒，可探测微弱的信号，动态范围大。2.5记录显示系统和仪器软件仪器的记录显示系统和软件的功能是分析仪器自动化、智能化的关键因素，可极大地提升仪器的使用性能和价值。这部分装置发展较快。较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。部件传统新技术光源钨灯和氘灯氙灯、光纤光源、紫外二级管（LED）分光系统单色器双单色器光栅棱镜和机刻光栅全息光栅检测器光电倍增管阵列型光电检测器紫外可见分光光度计的发展趋势自动化智能化小型化伴随着光电子技术和微机电系统技术的发展，有可能将分光原件和探测器集成在一块基片上，制作成微型紫外可见分光光度计。PORS-15---普析通用公司190×170×100mm3(一)按仪器使用波长分类：①真空紫外分光光度计（0.1-200nm）；②可见分光光度计（350-700nm）；③紫外-可见分光光度计（190-1100nm）；④紫外-可见-红外分光光度计（190-2500nm）；（二）按仪器使用的光学系统分类：①单光束分光光度计；②双光束分光光度计③双波长分光光度计三、紫外-可见分光光度计的分类及特点3.1单波长单光束分光光度计简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。3.2单波长双光束分光光度计自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。3.3双波长分光光度计由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，将不同波长的两束单色光(λ1、λ2)通过折波器以一定的频率交替通过同一样品池，然后由检测器交替接收信号，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA。无需参比池，ΔA就是扣除了背景吸收的吸光度。Δ=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。双波长BECKMAN-DU_640四、试剂和反应的改进探索新的显色试剂、离子和分子试剂、人工模拟酶和增效试剂，改造原有的分子结构、进行功能团修饰以及研究新的反应体系，优化反应条件和控制反应速度等，力求进一步改善反应的分析性能，简化操作步骤，这是光度分析的基础，目前最活跃的研究领域，也是最基础的研究工作。4.1试剂杂环偶氮类、荧光酮类、腙类、三氮烯类和染料等新试剂的合成与应用仍然是研究的热点。此类试剂的显色反应已涉及周期表中绝大部分元素。多数金属离子的有色多元络合体系的ε可达105L/mol·cm级别，成为光度分析中最重要和最灵敏的分析体系。大环化合物是近年来发展最迅速的一类试剂。大环化合物作为分析试剂，它可以是借助其分子腔来实现分子或离子的选择性识别，也可以是以离子型分子或中性分子与客体形成可测定的络合物，还可以是以金属化合物作为模拟酶起作用。此类试剂通常选择性均较高。冠醚类试剂目前冠醚类试剂已在生化及临床分析中得到广泛应用，如可测定血清、尿、鱼肉等样品中微量的Ca2+、Li+、Na+、K+、Ag+、Pb2+和Cu2+等。卟啉类化合物金属卟啉络合物通常水溶性差，反应速度慢，目前已有水溶性试剂合成，并将其与金属反应速度的差异应用于动力学多组分同时测定。杯芳烃类衍生物杯芳烃衍生物因易于进行各种修饰剂调节空腔大小而成为受人注目的试剂，在化学分离、色谱分析、电化学分析及毛细管电泳中得到应用。在光度分析中，被修饰过的杯芳烃常被用作高选择性显色试剂。4.2反应和方法多元络合反应分子识别反应胶束介质反应由于多元络合物分子的光吸收界面较相应二元体系增大，测定灵敏度通常可获得明显提高。某些痕量金属元素是生物体内金属蛋白及酶的组成部分，基于多元络合反应的光度分析是测定这些痕量元素的有效手段之一。应用多配位络合反应、多核络合反应，特别是金属离子-阴离子-染料的缔合反应结合胶束增敏、浮选富集等，可大大增加灵敏度。五、紫外可见分光光度技术与其他技术联用试样前处理、化学分离和富集是传统光度分析操作中的薄弱环节，研究与其它分析和分离技术的良好结合和联用，是现代光度分析的热点，也是前沿课题之一。5.1流动注射分析技术（FIA）光度法与FIA结合的优点是试样和试剂用量少，样品的分解、溶液的稀释、转移、分离和富集均可由微机自动控制，且反应在密闭体系中进行，因而简化了操作，避免了玷污及手工操作所引起的人为误差，是准确度和精密度获得提高，一般的进样频率达到每小时数十次到数百次，更易实现自动化。5.2液相色谱和毛细管电泳光度检测光度法是包括离子色谱在内的液相色谱及毛细管电泳最常用的检测手段，它的灵敏度和选择性好，而且对湿度、冲洗剂组成的变化不敏感。毛细管电泳法统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异实现分离的一种液相分离技术。5.3浊点萃取（CPE）CPE是近年来出现的一种新兴的液-液萃取技术，其以表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，通过改变溶液pH值、离子强度、温度等参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离，同时起到富集的作用。浊点萃取与紫外可见分光光度技术联用，不仅能富集待测元素，降低干扰元素对测定元素的干扰，而且能降低检出限。何微娜等将两者相结合，成功测定了维生素Ｂ12片中钴的含量，检出限(3s)为0.4998μg·L-1。5.4动力学光度法解决在光化学反应、辐射化学反应和酶催化反应中，能量转化、酶的降解、生物合成等的反应变化。特点：时间辨别、快速扫描、测定生物化学瞬间产物的吸收光谱和随时间变化值。5.5固相光度法将有色络合物吸附或萃取在固相离子交换树脂上，再在固相上进行光度测定，往往是分离和富集同时完成，也可在HPLC和FIA中应用，利用导数技术降低或消除背景的影响。方法简单、快速、灵敏度高、选择性好，易于实现自动操作，特别适于环境水样等样品的分析。结语光度方法作为一种常用检测手段仍将会得到应用和发展。传统分光光度法与各种高效分离方法，如色谱、毛细管电泳的连用和与仿生学、化学计量学、动力学和流动分析的结合将是广度分析最具发展前景的研究方向，且将会在生命科学、环境科学、新材料科学及医药学的研究中继续发挥作用。2多组分体系的测定进展在分光光度分析法中，对于吸收曲线严重重叠的多组分的测定，一般是将组分分离后逐个进行测定。近年来因计算数学的发展及计算机应用的普及而迅速发展起来的计算分光光度法，是一种不经分离同时测定多组分体系的快速、有效的方法。此类方法主要有：ＡＫＣ矩阵法、Ｈ－ｐｏｉｎｔ标准加入法、最小二乘法、小波变换法、ＣＰＡ矩阵法、岭回归法、偏最小二乘（ＰＬＳ）法、卡尔曼（Ｋａｌｍａｎ）滤波法、人工神经网络（ＡＮＮ）法。四、紫外可见分光光度计的最新应用1.“褶合光谱”法“褶合光谱”法是我国第二军医大学的吴玉田教授发明的。此法测量样品时，不需要对试样经过分离,可以直接用紫外可见分光光度计分析含有6个不同组分的试样。此法对于药物分析工作来讲,是一个重大的突破,在新药开发、疾病诊断、食品科学、产品质控、环境毒性分析等领域有广阔的应用前景。