鲁米诺化学发光分析在药物分析中的研究

1鲁米诺化学发光分析在药物分析中的研究化学教育2000级3班梁斐指导老师：张成孝教授摘要:化学发光分析法是根据化学反应产生的光辐射的强度来确定物质含量的分析方法。该分析方法具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、分析速度快、容易实现自动化等优点，受到人们的广泛关注。本论文利用鲁米诺体系流动注射化学发光法，建立了双嘧达莫和异烟肼的化学发光分析法。我们在实验中发现，将含氮杂环的嘧啶类合成药物双嘧达莫溶液注入鲁米诺与铁氰化钾化学发光反应结束后的混合溶液中可产生强的化学发光信号。根据此实验现象并结合流动注射分析技术，建立了测定双嘧达莫的化学发光分析法。在优化的实验条件下，化学发光分析信号与双嘧达莫的浓度在1×10-10~4×10-7g/mL之间呈良好的线性关系。根据IUPAC规定，计算得该方法的检出限为6×10-11g/mL。对1×10-8g/mL的双嘧达莫进行7次平行测量，相对标准偏差为1.1%。该方法用于双嘧达莫片剂中双嘧达莫含量的测定，并与药典中标准方法进行对照，没有显著性差异。实验发现将异烟肼溶液注入鲁米诺与高锰酸钾化学发光反应结束后的混合溶液中可产生强的化学发光信号。根据此实验现象并结合流动注射分析技术，建立了测定异烟肼的化学发光分析法。在优化的实验条件下，化学发光分析信号与异烟肼的浓度在5×10-8~1×10-4g/mL之间呈良好的线性关系。根据IUPAC规定，计算得该方法的检出限为1×10-8g/mL。对1×10-6g/mL的异烟肼进行7次平行测量，相对标准偏差为1.1%。该方法用于异烟肼片剂中异烟肼含量的测定，结果令人满意。关键词：流动注射分析化学发光反应鲁米诺双嘧达莫异烟肼2TheanalyticalapplicationofluminolchemiluminescenceinPharmaceuticalassayLiangFeiZhangChengxiaoprofessorAbstract：Chemiluminescence(CL)analysispromiseshighsensitivitywithsimpleinstrumentation(nomonochromatorrequired)andrapidlyinsignaldetection(normally0.1-10s).Whencoupledwithflowinjectionanalysis(FIA),CL-basedFIAmethodsprovidecheap,rapid,simpleandreproduciblemeansofdetectionandtherefore,ithasbeenextensivelyusedinmanyfields,suchasbiological,clinical,environmental.Whendipyridamole(DIP)wasinjectedintothereactionmixtureafterthefinishofthereactionbetweenluminolandK3Fe(CN)6,anewCLreactionwasinitiatedtoproducestrongCLemission.Basedonthisphenomenon,anovelCLsystemforDIPcombinedwithflowinjectionanalysiswaspresentedinthispaper.TheCLintensityrespondedlinearlytotheconcentrationofDIPintherangeof1×10-10~4×10-7g/mLwithadetectionlimitof6×10-11g/mL.Therelativestandarddeviationwas1.1%for1×10-8g/mLDIPsolution(n=7).ThemethodhasbeenappliedtodetermineDIPintabletsandtheresultsareinagreementwithtraditionalmethodusingUVspectrometry.ItwasfoundthatastrongCLsignalwasproducedwhenisoniazidwasinjectedintothereactionmixtureafterthefinishofthereactionbetweenluminolandKMnO4.Basedonthisfinding,asimpleflowinjectionCLmethodwasestablishedfordeterminationofisoniazid.Undertheoptimizedcondition,theCLsignalsrespondedlinearlytotheconcentrationofisoniazidfrom5×10-8g/mLto1×10-4g/mLwiththedetectionlimitof1×10-8g/mLisoniazid.Therelativestandarddeviationwas1.1%for1×10-6g/mLisoniazid(n=7).Thismethoddevelopedhasbeenappliedtodetermineisoniazidintabletswithsatisfactoryresults.Keywords:Flow-injectionanalysis;Chemiluminescencereaction;Luminol;Dipyridamole；Isoniazid3一引言化学发光是在化学反应的中间体或反应产物吸收了化学反应释放出的化学能由基态跃迁至电子激发态，并由电子激发态返回基态时所产生的光辐射。根据化学反应产生的光辐射的强度来确定物质含量的分析方法称为化学发光分析法。化学发光分析法具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、分析快速、容易实现自动化等优点。发光现象最早发现在生物体（如萤火虫）内，现在称之为生物发光（Bioluminescence）。1877年，Radziszewski[1]观察到洛粉碱在碱性乙醇介质中通入氧时可产生绿色的光。1888年Weidemann首次提出了化学发光(Chemiluminescence)这个专业术语。化学发光现象广泛存在于自然界中，但是由于大多数反应的化学发光效率太低，以及由于早期检测器灵敏度的限制，使得化学发光反应在分析化学中的应用受到限制，直到二十世纪六、七十年代，化学发光分析法才得到了快速发展，尤其在二十世纪的最后十年里发展非常迅速。化学发光分析法在无机物、有机物和生物物质的痕量和超痕量分析领域得到了广泛应用，为生命科学、环境科学、材料科学的研究提供了许多高灵敏度有效的分析方法，推动了这方面科学理论和高新技术的发展；同时，其他相关学科的研究成果也为化学发光分析和生物发光分析的建立提供了许多新的技术和手段，出现了许多新的化学发光分析方法，如纳米发光、发光成像、发光活体分析法。由于流动注射分析技术的发展，流动注射化学发光仪被广泛使用，配备微机系统，自动进样，储存记录，打印结果，使得化学发光分析的速度更快。随着药物分析的不断发展，它不但要求分析结果准确可靠，且要求分析方法简单快速，尤其是对痕量和微量药物分析，流动注射化学发光分析法更是显现出了其它分析方法不可替代的重要地位。近年来有多篇文章对化学发光分析进行了较全面的评述[1-5]。鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼）是使用最早、应用最广泛且量子产率较高的化学发光试剂之一。自从1928年，Albrecht首次报道了鲁米诺与氧化剂在碱性溶液中的化学发光行为以来，该化学发光反应主要被用来测定氧化剂与无机金属离子。最近几年来人们在进一步研究该化学发光反应的同时，将其与许多分析技术相结合，使得其应用范围不断扩大，已被广泛应用于包括药物分析，生化分析在内的各个分析领域。近年来，人们发现许多药物如肾上腺素[6]、异丙肾上腺素[6，7]、异烟肼[8,9]、单宁[10]、氨比西林[11]、羟氨苄青霉素[11]、核黄素[12]、五氟利多[13]、维生素B6[14]、抗坏血酸[15]、硫酸链霉素酸[16]、氯丙嗪[17,18]、盐酸异丙嗪[18]、甲硝4唑[19]、酚磺乙胺[20]等，对鲁米诺-无机氧化剂（高碘酸钾、铁氰化钾、高锰酸钾等）化学发光体系具有增敏作用，并且根据增敏现象建立了这些药物的化学发光分析法。双嘧达莫（DIP）为一含氮杂环的嘧啶类合成药物，是较强的冠状动脉血管扩张剂，临床上主要用于治疗和预防心绞痛、心肌梗死。目前测定双嘧达莫的方法有高效液相色谱法[21，22]，电化学法[23]，荧光法[24，25]，磷光分析法[26，27]，分光光度法[28]，化学发光法[29-32]等，其中化学发光法具有灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点，将其与流动注射相结合，更兼有分析速度快，精度高、易实现自动化等特点。我们在实验中发现，将DIP注入鲁米诺与铁氰化钾反应结束后的混合溶液中又可引发新的化学发光反应，产生强的化学发光信号，而且luminol-K3Fe(CN)6-DIP体系的化学发光强度与DIP的浓度成线性关系，从而建立了测定DIP的新方法，该方法具有灵敏度高，线性范围宽等优点。异烟肼(Isoniazid)，别名雷米封，是目前广泛使用的有效抗结核病药物之一[33]，对结核杆菌有较强的抑制和杀灭作用，临床上主要用于各种类型的结核病，如肺结核、结核性脑膜炎等的治疗。目前文献报道的异烟肼测定方法主要有分光光度法[34-36]、电化学法[37]、荧光法[38]和化学发光分析法[39-44]。其中化学发光法具有灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点，将其与流动注射相结合，更兼有分析速度快，精度高、易实现自动化等特点。实验发现，在碱性条件下，高锰酸钾能直接氧化异烟肼产生弱的化学发光，将异烟肼注入鲁米诺与高锰酸钾反应结束后的混合溶液中又可引发新的化学发光反应，产生强的发光信号，而且luminol-KMnO4-isoniazid体系的化学发光强度与异烟肼的浓度成线性关系，从而建立了测定异烟肼的新方法，该方法具有灵敏度高，线性范围宽等优点。二实验部分（一）试剂和仪器鲁米诺储备液（2.5×10-2mol/L）：准确称取4.43g鲁米诺（sigma公司），用0.1mol/LNaOH溶解并定容于1000mL容量瓶中，避光保存，放置一周后使用。双嘧达莫标准溶液(5.0×10-4g/mL)：准确称取双嘧达莫标准品50.0mg(中国药品生物制品检定所)，用少量乙醇溶解，转移至100mL的棕色容量瓶中，用水稀释至标线，在4C避光保存。使用时用二次蒸馏水稀释至所需浓度。异烟肼标准溶液(1.0×10-3g/mL)：准确称取异烟肼标准品100mg(上海化学试剂厂)，溶于水，将溶液转移至100mL的棕色容量瓶中，用水定容，摇匀，4C避光保存。使用时用二次蒸馏水稀释至不同浓度。5高锰酸钾储备液（1.0×10-2mol/L）：称取1.58g高锰酸钾溶解于1000mL沸水中，玻璃纤维过滤，室温下放置一周后使用。铁氰化钾贮备液（1.0×10-2mol/L）用二次水配制，并避光保存。实验所用试剂均为分析纯，水为去离子二次蒸馏水。IFFL-DD型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈电子科技有限公司)；BPCL超微弱化学发光分析仪(中科院北京生物物理研究所)；TU-1900型紫外-可见（UV）光谱仪（北京普析通用仪器有限公司）；970CRT荧光分光光度计（上海分析仪器总厂）；化学发光光谱用改装的RF-540型荧光光度计（Shimadzu,日本）绘制。（二）实验方法实验流路如图1-1所示，将100μL标准溶液或样品溶液注入载流水中，鲁米诺与氧化剂溶液分别经c和d管道混合后与样品溶液混合进入流通池（泵管均为内径0.8mm的PTFE管），发光信号由光电倍增管检测，以峰高定量。数据的采集、处理用Windows98界面下的Measure软件来完成。实验参数由IFFL-DD型流动注射化学发光分析