鸽Ⅰ型副黏病毒PL分离株F基因的克隆及其DNA疫苗的研究

鸽Ⅰ型副黏病毒PL分离株F基因的克隆及其DNA疫苗的研究摘要：根据GenBank报道的鸽Ⅰ型副黏病毒F基因序列设计了一对引物，以鸡新城疫病毒PL分离株基因组为模板，通过RT-PCR扩增出了1.66kb左右的F基因片段，序列分析表明PL株F基因与国内外17株鸽Ⅰ型副黏病毒或鸡新城疫F基因核苷酸序列的同源性为76.3-98.6%。将PL株F基因插入真核表达载体PCDNA3.1V5HIS中，构建了真核表达质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F，将构建的真核表达重组质粒免疫1月龄非免疫新城疫的乳鸽，剂量为100μg/羽，2周后加强免疫1次，并在免疫后0d、7d、14d、21d、28d翼下静脉采血分离血清，用间接ELISA分别检测各组血清抗体，ELISA检测结果表明：真核表达质粒免疫乳鸽后产生的抗体与鸽Ⅰ型副黏病毒F蛋白发生特异性反应，在免疫第7d开始有抗体产生，在免疫14d抗体水平达到最高，之后抗体水平开始下降，说明F蛋白具有很好的免疫原性。以真核表达重组质粒免疫乳鸽第28天以100倍鸡胚半数感染剂量(EID50)的F基因同源病毒对所有乳鸽进行攻毒。结果显示重组质粒免疫组和鸽新城疫蜂胶灭活苗免疫组的免疫保护率分别为33.3%和100%，显著高于生理盐水组和PCDNA3.1V5HIS空载体组，鸽新城疫蜂胶佐剂灭活苗组的免疫保护率也显著高于重组质粒组。表明所构建的F基因真核表达质粒可作为候选基因疫苗诱导乳鸽产生免疫保护反应，但还需其他方法来提高其免疫效率。关键词：鸽Ⅰ型副黏病毒；F基因；克隆；鸽Ⅰ型副黏病毒(PigeonParamyxovirus1,PPMV-Ⅰ)病又称鸽瘟或鸽新城疫，是一种由禽Ⅰ型副黏病毒(AvianParamyxovirus1,PMV-Ⅰ)引起的、流行于鸽群的高度接触性急性传染病，它以肠炎、严重腹泻和神经症状为特征，是危害养鸽业的主要疫病之一[1,2]。有资料记载，1952年Hanson和Sinha首先在PoultryScience杂志上报道了鸽的一种类似鸡新城疫的疾病，此后Ahmed和Sabri(1969)，Stewart(1971)，Hilbrich(1972)，Vindevogel等(1972)，Maes等(1974)以及Canic(1981)先后有报道[3,4]。但是，后来经过血清学及分子水平研究确诊并为大多数学者公认的鸽I型副粘病毒首例报道是1977年发生在伊拉克的鸽Ⅰ型副黏病毒疫情。不过，当时一些学者认为是由疱疹病毒引起，他们称之为鸽疱疹性脑脊髓炎病毒，Schrag则认为是A/PMV-3[5,6]。1981年，苏丹，埃及又爆发疫情，从此疫情很快扩散波及到地中海国家，随之进入法国和德国[5]，随后迅速传播到欧洲、美国、加拿大等地[1-3]，到1985年已传播到亚洲。在1986年前后，我国的鸽群中也发现了该病[7]，现流行全国各省市[8,9]。鸽Ⅰ型副粘病毒对不同品种、不同年龄的鸽都有感染性，传播迅速，死亡率高。目前防治鸽Ⅰ型副粘病最有效的方式是注射疫苗，但针对鸽Ⅰ型副粘病的疫苗市场很少见，主要用鸡新城疫（ND）疫苗防治鸽Ⅰ型副粘病，虽然PPMV-1与NDV存在较高的交叉反应，不少学者也认为新城疫疫苗能预防鸽Ⅰ型副粘病毒感染，但在生产实践中这种免疫效果常不够确实、有效。目前，治疗该病尚无特效药，许多研究人员都在致力于研究一种有效的疫苗或药物防治此病，加大鸽Ⅰ型副粘病病毒新型疫苗的研发力度成为鸽新城疫防治的当务之急。PPMV-1具有与NDV相似的特性，病毒表面的血凝素和神经氨酸酶(HN)能凝集鸡和某些哺乳动物红细胞，这种凝集作用可被特异性血清所抑制。病毒的基因组为一条单股负链RNA，长约15kb，包括6个基因：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,其中F基因所编码的融合蛋白在病毒对细胞的穿透、溶血及细胞与细胞之间的融合方面起主要作用,决定病毒毒力的主要因素[10]，可以作为研制亚单位疫苗、活载体疫苗和DNA疫苗的候选基因。上世纪80年代末，国内开始新城疫重组DNA基因工程疫苗的研制，在亚单位疫苗、活载体疫苗和核酸疫苗方面的研究。核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内,并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗可诱导机体产生全面的免疫应答，而且具有安全可靠、制备简单、同种异株交叉保护、可产生持久免疫等优点，核酸疫苗被认为是继灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗之后的第三代疫苗。本研究克隆了鸽Ⅰ型副黏病毒PL株F基因，构建了真核表达质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F，并对其免疫保护性进行了初步研究。1.材料与方法1.1材料1.1.1毒株、实验动物：鸽Ⅰ型副黏病毒PL株：分离自甘肃省平凉市崆峒区某鸽场的发病鸽群，有甘肃省畜牧兽医研究所鉴定并保存。试验乳鸽，购自甘肃平凉某鸽场。1.1.2主要试剂：PCDNA3.1V5HIS质粒由中国农业科学院兰州兽医研究所人兽共患实验室馈赠。E.coilDH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司。pMD-18T载体、DNAMarkerDL-000、T4DNA连接酶、RNAisoPlus提取试剂、一步法反转录试剂盒（PrimeScript®OneStepRT-PCRKitVer.2）、胶回收试剂盒、限制性内切酶等均购TaKaRa公司。PPMV-ⅠF-ELISA抗体检测试剂盒，有本实验室制备。其它试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1PPMV-ⅠPL分离株的克隆与序列分析：根据GenBank公布的新城疫F基因序列，设计一对引物P1和P2，跨幅为1.66kb,引物序列见表1.表1.RT-PCR扩增所用的引物及其序列引物引物序列P1ATGGGCTCCAAACCTTCTACP2TCATGCTCTTGTAGTGG取出-20℃保存的PPMV-ⅠPL分离株鸡胚尿囊液500μL，按照TaKaRa公司说明书，从尿囊液中提取RNA，将沉淀风干的RNA加入适量RNAase-free水溶解，-80℃保存备用。按照PrimeScript®OneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒说明书，依次加入2×1StepBuffer、P1、P2、PrimeScript1StepEnzymeMix、提取的RNA模版和RNaseFreedH2O，轻轻微弹，瞬时离心，混匀后按照下列条件进行RT-PCR扩增：50℃30min、94℃2min，94℃30sec、55℃30sec、72℃2min，30个循环，反应结束后，取RT-PCR反应液5-10μl进行琼脂糖凝胶电泳。将RT-PCR扩增的F基因与pMD-18T载体连接，转化DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性菌落提取质粒，重组质粒命名为pMD-18T-PPMV-1-F，将含F基因的重组质粒pMD-18T-PPMV-1-F送上海英俊生物科技有限公司测序鉴定。将PPMV-ⅠPL分离株通过BLAST与GenBank中与国内外17株鸽Ⅰ型副黏病毒或鸡新城疫F基因核苷酸序列的同源性分析。1.2.2PPMV-ⅠPL分离株F基因真核表达载体的构建与大量制备：根据重组质粒pMD-18T-PPMV-1-F的测序结果，设计一对引物P3和P4，P3和P4的5′分别加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，并加保护碱基，跨幅约为1.66kb,引物序列见表2。表2.重组真核质粒PCR扩增所用的引物及其序列引物引物序列P3CGCGGATCCGCCACCATGGGCTCCAAACCTTCTP4CCGCTCGAGCATGTAGTGGCTCTCATCTG以pMD-18T-PPMV-1-F为模版，P3和P4作为上下游扩增引物进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5min，94℃50sec，55℃50sec，72℃2min30个循环，72℃延伸10min。扩增完成之后，取PCR产物5μL在1.0%琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增产物的大小正确后用DNA胶回收试剂盒回收、纯化。纯化的F基因PCR回收产物和PCDNA3.1V5HIS载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，将F基因片段与线性化的PCDNA3.1V5HIS载体片段进行连接，转化DH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性菌落提取质粒，重组质粒命名为PCDNA3.1-PPMV-1-F，将含F基因的重组质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F送上海英俊生物科技有限公司测序鉴定。按分子克隆方法进行重组质粒的大量制备。1.2.3PPMV-ⅠPL分离株F基因表达产物的动物基因免疫：60只30日龄非免疫新城疫疫苗乳鸽分为四组，每组15只。分别在胸部肌肉注射生理盐水、PCDNA3.1V5HIS空载体100μg/羽、PCDNA3.1-PPMV-1-F100μg/羽、鸽新城疫蜂胶灭活苗0.5mL/羽。将试验组重组质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F分点注射试验试验鸽胸部肌肉；对照组按同样方法注射pcDNA3.1空载体。14d重组质粒试验组加强免疫1次。并在免疫后0d、7d、14d、21d、28d翼下静脉采血分离血清，用PPMV-ⅠF-ELISA抗体检测试剂盒分别检测各组血清抗体。1.2.4PPMV-ⅠPL分离株F基因表达产物的攻毒保护试验：在首免28日龄所有试验鸽用100倍鸡胚半数感染剂量(EID50)的F基因同源病毒对所有乳鸽进行攻毒，按组隔离饲养，逐日详细观察至攻毒后7d，统计发病数和死亡数，计算免疫保护率。2.结果2.1PPMV-ⅠPL分离株的RT-PCR扩增结果：图1.RT-PCR产物电泳图1.RT-PCR扩增12.RT-PCR扩增23.空白对照Ｍ．DNAMark图2.菌落PCR电泳图1.1,2,5,6,7,8为阳性菌落2.3，4为阴性菌落Ｍ．DNAMark从图1可以看出，RT-PCR扩增的F基因片段大小为1.66kb,与实验设计相符。2.2PPMV-ⅠPL分离株F基因重组质粒的PCR筛选:将RT-PCR扩增的F基因与pMD-18T载体连接，转化DH5α感受态细胞，用菌落PCR对重组阳性菌进行筛选（见图2），可以看出所选取的8个菌落有六个为阳性重组菌落，选取菌落提取质粒进行测序鉴定，结果测序真确，表明获得了PPMV-ⅠPL分离株F基因，阳性重组质粒命名为pMD-18T-PPMV-1-F。2.3PPMV-ⅠPL分离株F基因与参考毒株的同源性分析：测序结果表明，pMD-18T-PPMV-1-F中F基因的大小为1662bp的片段，该片段与预期结果完全相符，为完整的F基因序列。通过BLAST与GenBank中来自国内外鸽源和鸡源部分新城疫毒株进行相似性比较，结果与17个毒株之间的相似性介于76.3-98.6%。该结果表明我们所分离的鸽新城疫与Chichen-Massachusette-344783、Pigen-Minnesota-729的亲缘关系最远，相似性只有76.3%，与strainGZ株的亲缘关系最近，相似性高达98.6%，结果如图3所示图３．PPMV-1-PL与其它副粘病毒的核苷酸相似性比较2.4重组表达质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F的构建与鉴定：用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切目的片段和载体，分别回收后将二者相连，转化DH5α感受态细胞，用菌落PCR对重组阳性菌进行筛选（见图4），可以看出所选取的5个菌落有2个为阳性重组菌落，选取菌落提取质粒进行测序鉴定，结果测序真确，表明获得了PPMV-ⅠPL分离株F基因真核表达重组质粒，阳性重组质粒命名为PCDNA3.1-PPMV-1-F。图3-1：菌落PCR鉴定电泳结果1：1，3阳性重组质粒2：2，4，5阴性重组质粒M：DNA分子量标准；2.5PPMV-ⅠPL分离株F基因表达产物的动物基因免疫结果：由间接ELISA检测结果的OD值数据可知，免疫后第七天，注射重组质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F和鸽新城疫蜂胶灭活苗组抗体水平开始升高，显著高于生理盐水组和PCDNA3.1空载体，14天时抗体水平达到最高，鸽新城疫蜂胶佐剂灭活苗组的抗体水平也显著高于重组质粒PCDN