高产谷胱甘肽酵母菌株的选育和培养条件的初探

高产谷胱甘肽酵母菌株的选育和培养条件的初探摘要：以SaccharomycescerevisiaeG796-2为出发菌株,通过紫外线照射结合乙硫氨酸平板筛选，连续两代诱变筛选分离得到高产突变株SaccharomycescerevisiaeSE-2；摇瓶试验胞内谷胱甘肽含量达到2.2%，较出发菌株G796-2提高62.9%，传代试验表明其遗传性能稳定。对SE-2的培养条件进行了研究。采用正交化实验和双碳源实验对培养基进行优化，结果表明，最佳初糖浓度6%，葡萄糖/糖蜜=3.5:1，半胱氨酸的添加浓度5mmoL⋅L−1较为适宜。在优化的培养条件下培养39h，SE-2谷胱甘肽总量达180mg⋅L−1以上,较G796-2提高81.2%。1前言谷胱甘肽，γ-L-谷氨酰-L-半谷氨酰-甘氨酸(γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine，简称GSH)是一种广泛存在于动植物和微生物细胞中具有多种生理功能的三肽[1]。发酵法生产GSH就是选育(或构建)GSH合成能力强和胞内含量高的微生物、筛选和优化培养基配方、建立和优化发酵控制策略、改进和提高下游过程技术等,最终提高GSH的产率和质量[2]。Sakato等[3]采用先进的YEWPACKINSTRMENTATIONSYSTEM控制系统发酵合成GSH。林建平等[4]利用啤酒废酵母合成GSH。采用发酵法生产GSH的关键，是获得性能优良的高产菌株。本课题组选用产GSH酵母菌株，经过两代紫外线诱变，乙硫氨酸耐性平板筛选，得到GSH含量更高的突变株，并对该突变株的培养条件进行研究。2材料与方法2.1实验材料2.1.1菌种酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)8株，本实验室保存菌株。2.1.2培养基：1)斜面与平板培养基(g⋅L−1)：麦芽汁10；酵母粉3；蛋白胨5；葡萄糖10；琼脂20。2)摇瓶筛选培养基(g⋅L−1)：葡萄糖30；酵母粉6；(NH4)2HPO43；K2HPO41；KH2PO41；MgSO40.8；CYS0.2；ATP0.2。3)摇瓶发酵培养基(g⋅L−1)：葡萄糖60；酵母粉12；(NH4)2HPO46；MgSO44.8；K2HPO41；KH2PO41；FeSO40.008；MnSO40.008；ZnSO40.008；玉米浆24；糖蜜17；麦汁30。2.2实验方法2.2.1培养和分析方法从活化斜面上挑取一环菌体接入摇瓶筛选培养基,装量为50mL/250mL三角瓶,置摇床170r⋅min−1，30℃培养39h。而发酵培养则是将24h种子液以10%的接种量，接入发酵培养基，装量50mL/250mL三角瓶，置摇床170r⋅min−1，30℃培养24h。GSH含量测定方法：四氧嘧啶法[5]。2.2.2诱变和筛选方法从活化斜面上挑取一环菌体接入液体培养基，置摇床170r⋅min−1，30℃培养16h，4000r⋅min−1离心收集菌体，以0.85%生理盐水洗涤，稀释制得107个细胞mL−1菌悬液。取5mL菌悬液置于直径9cm无菌平皿中,用紫外灯(功率15W,距离30cm)照射180s,将照射后菌液用0.85%生理盐水稀释104倍,吸取0.2mL涂布含0.3%氯化锂，100μg⋅mL−1乙硫氨酸筛选平板。30℃培养4~6天，挑选菌落进行筛选。第二代诱变就是将第一代诱变筛选出的高产菌株作为出发菌株，如上述条件培养，诱变，稀释，吸取0.2mL涂布含0.3%氯化锂，300μg⋅mL−1乙硫氨酸筛选平板。30℃培养4~6天，挑选菌落进行筛选。从筛选平板上挑取一定数量的抗性突变株至斜面培养基，培养2~3天后将菌株接入摇瓶筛选培养基，培养39h后测定GSH含量。挑取GSH含量提高的高产菌株进行复筛。复筛就是将初筛的较好的菌种，按每株3瓶，培养39小时后测GSH胞内含量，确定高产菌株。3结果与讨论3.1菌种诱变筛选将待筛选的8株酵母菌接入摇瓶培养基培养，其中G796-2的胞内含量最高，为1.35%，产量达39mg⋅L−1，作为诱变的出发菌株。对G796-2菌株进行紫外诱变后，涂布筛选平板，初筛得到高产突变株共17株，然后对这17株进行复筛，测定GSH含量，结果见表1。从表1看出，BU-14突变株GSH含量达到1.8%，可以作为进一步诱变的出发菌株。对BU-14进行第二代诱变，涂布筛选平板，初筛得到高产突变株共8株，然后对这8株进行复筛，测定GSH含量，结果见表2。从表2看出，SE-2含量达2.2%。同时对SE-2突变株和其它产GSH菌株在胞内含量和筛选方法进行了比较，结果见表3。以酿酒酵母S.cerevisiaeG796-2作为出发菌株，用紫外线诱变和乙硫氨酸耐性平板筛选方法，得到SE-2突变株，GSH含量提高62.9%。将突变株SE-2在斜面培养基连续传8代，每传2代用摇瓶筛选培养基测定GSH含量，结果见表4。从表4可以看出，突变株SE-2的GSH平均产量达80mg⋅L−1,胞内含量2.1%以上，菌株产GSH能力稳定。3.2SE-2高产突变株摇瓶培养条件的初探3.2.1正交优化实验首先研究不同浓度的初糖对GSH产量的影响。初糖浓度分别为3%，6%，9%，GSH产量分别为55.6mg⋅L−1，69.6mg⋅L−1，41.1mg⋅L−1。SE-2高产突变株培养最佳初糖浓度为6%。为了进一步优化摇瓶发酵培养基，又另添加糖蜜、玉米浆、麦汁和适量的微量元素。以玉米浆(16,24,32g⋅L−1)、MgSO4(3.6,4.8,6.0g⋅L−1)、糖蜜(15,30,45g⋅L−1)和麦汁(30,60,90/g⋅L−1)按照L9(34)4个因素3水平正交实验，共9组配方进行摇瓶培养实验，结果见表5。根据4个因素极差分析，RA＞RD＞RC＞RB，糖蜜是较重要的因素，玉米浆是较次要的因素。第一列因素K1＞K3＞K2(89.91＞84.21＞82.29)；第二列因素K2＞K1＞K3(87.06＞85.28＞84.47)；第三列因素K2＞K3＞K1(88.40＞84.87＞83.51)，第四列因素K1＞K2＞K3(89.19＞85.99＞81.63)。所以确定最佳实验条件为：A1B2C2D1。3.2.2双碳源优化实验从正交实验得到最佳培养基A1B2C2D1,其中的碳源有葡萄糖、糖蜜。这两种碳源中，葡萄糖对发酵影响较大，而糖蜜是正交实验中最重要的因素。所以有必要对这两碳源进一步优化，对糖蜜和葡萄糖这两种碳源重新按质量分配比例，对A1B2C2D1培养基作进一步改进。设计以下5组不同的培养基，葡萄糖/糖蜜质量比分别为4:1,3.5:1,3:1,2.5:1,2:1，进行摇瓶实验。结果见表6。双碳源优化实验第2组(记为TCSG2)葡萄糖/糖蜜质量比为3.5:1时，GSH产量达102.14mg⋅L−1，比正交实验A1B2C2D1培养基GSH产量要高。3.2.3半胱氨酸的影响AlfafaraCG等[9]研究了甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸3种前体对酵母菌以葡萄糖为碳源合成GSH的影响，表明半胱氨酸(CYS)是促进GSH合成关键氨基酸。将优化后的发酵培养基TCSG2分别加入0，5，10mmol的CYS，分别将出发菌株G796-2和高产突变株SE-2的24h种子培养液以10%的接种接入这3组培养基，装量50mL/250mL三角瓶，置摇床170r⋅min−1，30℃培养48h。分别取24h，39h，48h培养液测定GSH产量。结果见表7。当培养基中的CYS含量在5mmol⋅L−1时，GSH产量大幅度提高；当CYS含量大于10mol⋅L−1时，GSH产量较5mmol⋅L−1下降，可能是CYS浓度较大对GSH的合成不利。高产突变株SE-2利用CYS的能力明显大于出发菌株G796-2，GSH产量达180mg⋅L−1以上，较出发菌株G796-2提高81.2%。4结论(1)对出发菌株G796-2紫外线诱变结合乙硫氨酸筛选分离得到高产突变株SE-2，GSH胞内含量达到2.2%,较出发菌株G796-2提高62.9％,传代试验表明该突变株产GSH能力稳定。(2)采用正交实验和双碳源实验对发酵培养基进行优化，初糖浓度6%，葡萄糖/糖蜜=3.5:1。(3)CYS是GSH合成的重要前体，分别以出发菌株G796-2和高产突变株SE-2在发酵培养基中添加了CYS，GSH产量有了显著的增加，添加浓度5mmol⋅L−1较好。在经过优化的培养基培养39h，高产突变株SE-2GSH产量达180mg⋅L−1以上，较出发菌株G796-2提高81.2%。参考文献：[1]SHENYa-lin(沈亚领).Usageandproductionofglutathione(谷胱甘肽的应用与生产)[J].IndustrialMicrobiology(工业微生物),2000,30(2):41-45.[2]LIHua-zhong(李华钟),LINJin-ping(林金萍),LIYin(李寅),CHENJian(陈坚),LUNShi-yi(伦世仪).Biosynthesisofglutathione(谷胱甘肽的生物合成)[J].ChineseJournalofPharmaceuticals(中国医药工业杂志),2000,31(5):236-239,217.[3]SakotaK,TanakaH,etal.Advancedcontrolofglutathionefermentationprocess[J].BiotechnologyandBioengineering,1992,40:904-912.[4]LINJian-ping(林建平),YOUJian-feng(游剑锋),SHENGXiao-xia(盛晓霞),ZHANGQin(张琴),CENPei-lin(岑沛霖).Studyonthebatchfermentationfortheproductionofglutathionewithspentbrewer’syeast(利用啤酒废酵母间歇发酵合成谷胱甘肽的研究)[J].JChemEngofChineseUniv(高校化学工程学报),2003,17(6):689-694.[5]ShanghaiPharmaceuticalTestInstitute(上海市医学化验所).ClinicBiochemicalTestHandbook(临床生化检验上册)[M],Shanghai(上海):ShanghaiScienceandTechnologyPress(上海科学技术出版社),1979,85.[6]SHIBi-hong(施碧红),HUANGJian-zhong(黄建忠),SHIQiao-qin(施巧琴),WUSong-gang(吴松刚).StudyonthesynthesisofglutathionebySaccharomycescerevisiaeMutantM-05I.Breedingofhighglutathioneproductionstrain(啤酒酵母M-05突变株合成谷胱甘肽的研究)[J].JournalofFujianNormalUniversity(福建师范大学学报),1996,12(4):91-95.[7]WUJian-ping(吴坚平).ProductionProcessofGSHandStudyofitsKinetics(谷胱甘肽生产工艺及动力学研究)[D],Hangzhou(杭州):ZhejiangUniversity(浙江大学),2000,6:31-32.[8]ZHANGu-yu(詹谷宇).Biosynthesisofglutathioneinyeasts(酵母菌生物合成谷胱甘肽)[J].ActaPharmaceuticaSinica(药物学报),1990,25(7):494-499.[9]AlfafaraCG,MiuraK,ShimizuH,etal.Cysteineadditionstrategyformaximumglutathioneproductioninfed-batchcultureofSaccharomycescerevisiae[