高效液相-电化学法测定大鼠血浆中单胺类神经递质及其代谢产物

1高效液相-电化学法测定大鼠血浆中单胺类神经递质及其代谢产物崔翰明，白鸽，黄世敬，张春光，张秋燕（中国中医科学院广安门医院，北京100053）[摘要]目的：建立高效液相色谱-库仑阵列电化学法测定大鼠血浆中的单胺类神经递质及其代谢产物含量的分析方法。方法：采用Agilent公司的1200型高效液相色谱仪和ESA公司库仑2通道电化学检测器，以3，4二羟基苄胺（DHBA）为内标，测定大鼠血浆中的肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、高香草酸（HVA）和5-羟色胺（5-HT）的含量。色谱柱：ZorbaxEclipseXDB-C18（4.6mm×150mm,5μm），加EasyGuard预柱；流动相：含一水合柠檬酸80mmol•L-1，柠檬酸三钠73.4mmol•L-1，1－辛烷磺酸钠0.12mmol•L-1，乙二胺四乙酸二钠0.1mmol•L-1，18％甲醇的混合溶液，pH4.3；流速：1.0mL•min-1；柱温：25℃；进样量：10μL；测定电极电势：-150mv和400mv。结果：NE、E、DA、HVA和5-HT的最低检测浓度分别为2.0，3.0，5.4，5.2，11.1ng•mL-1；平均回收率分别为99.72％、85.33％、83.15％、120.43％、103.56％；日内(n=6)和日间(n=3)精密度RSD小于9.12％。结论：本方法操作简便，准确，快速，灵敏度高。可用于大鼠血浆中相关单胺类神经递质的检测和研究。[关键词]单胺类神经递质；高效液相色谱；库仑阵列电化学检测器；儿茶酚胺MeasurementofmonoaminesneurotransmitterandtheirmetabolitesinratplasmabyHPLCwithCoularrayDetactionCUIHan-ming，BAIGe，HUANGShi-jing，ZHANGChun-guang，ZHANGQiu-yan(Guang’anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalScience,Beijing100053,China)[Abstract]ObjectiveToestablishameasurementmethodondeterminingthelevelofmonoaminesneurotransmitterandtheirmetabolitesinratplasmabyHPLCwithCoularrayDetector-2.MethodsThelevelofNE,E,DA,HVAand5-HTinratplasmaweredeterminedbyAgilent1200HPLCwithESACoularrayDetector-2.Mobilephaseconsistedof80mmol•L-1Citricacidmonohydrate,73.4mmol•L-1Citricacidtrisodiumsalt,0.12mmol•L-11-Octanesulfonicacidsodiumsalt,0.1mmol•L-1EDTA-Na2and18%methanolmixturesolution(pH4.3).Flowratewas1.0mL•min-1.TheColumnwasZorbaxEclipseXDB-C18（4.6mm×150mm,5μm）andEasyguardguardcolumnat25℃.Thevoltageofelectrodewas-150mvand【收稿日期】2009-07-03【通讯作者】崔翰明，Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]【基金项目】国家自然科学基金（编号：30672696）2400mv.ResultsTheminimummeasurementlimitofNE,E,DA,HVAand5-HTwere2.0,3.0,5.4,5.2and11.1ng•mL-1,respectively.Theaveragerecoverieswere99.72％,85.33％,83.15％,120.43％and103.56％,respectively.TheRSDofintra-day(n=6)andinter-day(n=3)werelessthan9.12%.ConclusionThemethodwaseasytooperate,rapid,accuracyandhighsensitivity,andcouldbeappliedinquantitydeterminationandstudyofmonoaminesneurotransmittersandtheirmetabolitesinratplasma.[Keywords]monoaminesneurotransmitter;HPLC;CoularrayECD;Catecholamines动物体内的单胺类神经递质及代谢产物主要有肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、高香草酸（HVA）、香草扁桃酸（VMA）、5-羟色胺（5-HT）和5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）等，其中结构为儿茶酚胺类的有E、NE、DA、HVA和VMA，结构为吲哚胺的有5-HT、5-HIAA。准确测定血浆中这些物质的浓度变化对于相关疾病的诊断和转归变化有重要意义。目前测定单胺类神经递质的方法通常有HPLC-ECD法、荧光法、放免分析法等。由于单胺类神经递质及代谢产物在体内含量很少且易氧化还原，同时血液样本成分复杂，干扰较多，适合于采用具有良好分离能力和测定灵敏度的高效液相色谱-电化学检测法[1,2]。本文采用HPLC-ECD法，建立了同时测定大鼠血浆中5种单胺类神经递质及代谢产物的含量测定方法。本方法具有快速简便、灵敏、准确的特点。1材料和方法1.1仪器美国Agilent公司的1200型高效液相色谱仪；ESA公司2通道库仑电化学检测器(Model5300ACoularrayDetector-2)，电极：ESAModel5011A高灵敏分析电极和5020保护电极；软件：Agilent公司ChemStationB.03.01Version；CF15D2型低温高速离心机；MILLIPORE超纯水器；SY7200DH超声波发生器；FA2104电子分析天平等。1.2试剂E、NE、DA、HVA、VMA、5-HT、5-HIAA、DHBA、1－辛烷磺酸钠、一水合柠檬酸、柠檬酸三钠，乙二胺四乙酸二钠均为Sigma产品；甲醇为Merck公司产品；高氯酸及其他试剂均为国产AR级；实验用水为超纯水。1.3色谱条件色谱柱：ZorbaxEclipseXDB-C18（4.6mm×150mm,5μm），预柱：EasyGuard保护柱（Dikma公司）；流动相：含一水合柠檬酸80mmol•L-1，柠檬酸三钠73.4mmol•L-1，1－辛烷磺酸钠0.12mmol•L-1，乙二胺四乙酸二钠0.1mmol•L-1，含18％甲醇的混合溶液，pH4.3；流速：1.0mL•min-1；柱温：25℃；进样器温度：4℃；进样量：10μL；测定电极电势：-150mv和400mv。1.4标准液的配制1.4.1标品母液的配制：精密称取VMA、NE、E、DHBA、DA、HVA、5-HT的标准品各3约1mg，分别溶于1mL蒸馏水中，得浓度约为1000μg•mL-1的母液。-80℃避光保存。母液浓度分别为：VMA：1.20mg•mL-1，DHBA：1.24mg•mL-1，E：1.13mg•mL-1，NE：1.09mg•mL-1，5-HT：1.26mg•mL-1，DA：1.04mg•mL-1，HVA：1.34mg•mL-1。1.4.2标品储备液和混合标品储备液的配制取标品母液各10μL，分别加入990μL蒸馏水，即得浓度约为10μg•mL-1的标品储备液。取标品母液各10μL充分混合，加入930μL蒸馏水混匀，即得浓度约为10μg•mL-1的混合标品储备液。-20℃避光保存。两周内使用。1.4.3标准品溶液的配制精密量取适量标品储备液，分别用流动相稀释，配制成浓度分别约为1，5，10，50，100，500ng•mL-1的标准品溶液，置4℃避光保存。1.5血浆样品的前处理：体重200~300g雄性SD大鼠，采用玻璃毛细管自眼眶采血或自股动脉抽血，置于肝素抗凝的EP管中，迅速4℃条件下12000×g低温离心15min，吸取血浆-80oC冻存备用。取冻存血浆，室温解冻，精密吸取100μL，加6.2ng•μL-1的DHBA内标液2μL,再加0.1M高氯酸100μL，混匀，再加浓高氯酸8μL，4℃条件下12000×g低温离心10min，上清液直接进样。2实验结果2.1色谱行为在上述色谱条件下,标品和血浆中的各峰型对称，无内源性杂质干扰峰，各峰分离效果较好。整个色谱可在12min完成，VMA、NE、E、DHBA、DA、HVA、5-HT保留时间分别见图1和图2。图1.混合标准品色谱图(1-7分别为VMA、NE、E、DHBA、DA、HVA、5-HT)图2.大鼠血浆样品中NE、E、DHBA、DA、HVA、5-HT色谱图42.2标准曲线由于血浆样本中均存在以上内源性生物胺，故无空白标本。本实验用NE、E、DHBA、DA、HVA、5-HT标准液稀释成500，100，50，10，5，1ng•mL-1的6个不同浓度，依次测定后以对照品峰面积比内标峰面积，对浓度进行线性回归并计算相关系数r。各回归方程分别为：NE：Y=790.54X+1.5969，r=0.9997；E：Y=712.89X+0.8929，r=0.9999；DA：Y=1078.6X+1.7465，r=0.9999；HVA：Y=1005.1X+0.8325，r=0.9999；5-HT：Y=586.46X+1.1751，r=0.9999。结果表明，NE、E、DA、HVA、5-HT在1~500ng•mL-1的浓度范围内线性良好。2.3血浆样品加样回收率取同1只大鼠血浆7份，其中6份血浆分别加入约50ng•mL-1的对照品标准液，分别按1.5血浆样品的前处理方法处理，按照1.3色谱条件测定，将加入标准液后测得的峰面积与内标峰面积的比值减去空白血浆样品测得的峰面积与内标的比值，根据标准曲线分别计算血浆中加入的NE、E、DA、HVA和5-HT的量，与实际加入量比较，计算各物质的回收率和RSD（%），结果见表1。表1加样回收试验结果（n=6x±S）被测物样品含量(ng•mL-1)测得量（ng•mL-1）加样回收率（%）RSD（%）NEEDAHVA5-HT54.556.552676354.35±0.2548.21±0.5243.24±0.8680.69±1.1265.24±0.3299.7285.3383.15120.43103.560.451.091.991.390.492.4精密度配制低、高两种不同浓度的混合标准液，NE、E、DHBA、DA、HVA、5-HT为10、50ng•mL-1。分装后贮存于-20oC冰箱内。日内连续测6次，计算日内精密度；每份样本连续测定3天，计算日间精密度。结果见表2。表2精密度结果（n=6或3x±S）被测物浓度（ng•mL-1）日内精密度（ng•mL-1）回收率（％）RSD(%)日间精密度（ng•mL-1）回收率（％）RSD(%)NE10.954.510.69±0.2553.65±1.6698.0798.442.343.0910.53±0.3253.05±1.7896.6198.883.043.36E11.356.511.06±0.5154.53±2.2397.8896.514.614.0910.68±0.9752.22±3.1894.5192.429.086.09DA10.45211.25±0.4854.48±2.68108.17104.774.274.9211.48±0.5554.52±2.86110.38104.854.795.25HVA13.46