杂交育种与基因工程

提高突变率，加快育种进程，大幅改良性状用物理、化学或生物方法处理生物诱变育种操作复杂，难度大提取，结合，导入，检测与表达基因工程育种多倍体育种发育缓慢、生长期长、结实率低明显缩短育种年限单倍体育种基因重组杂交育种缺点优点方法原理名称杂交→自交→连续自交选优基因突变具有不定向性，有利变异少，需处理大量的材料将不同个体的优良性状集中于一个体上花药离体培养，再秋水仙素处理使染色体加倍目的性强，能定向改造生物染色体变异秋水仙素处理萌发的种子或幼苗需与杂交育种配合，多限于植物染色体变异茎秆粗壮，营养丰富基因重组育种周期长，工作量大考点37：生物变异在育种上应用（Ⅱ）名称原理方法步骤优点缺点植物细胞全能性和细胞膜流动性去壁－原生质体融合－杂种细胞－组织培养－杂种植株克服了远缘杂交不亲和的障碍杂种植株还不能按照人们需要表现出两亲代的优良性状植物体细胞杂交动物细胞核移植（克隆）动物体细胞核的全能性将具备所需性状的体细胞核移植到去核卵细胞中－重组细胞－激活－重组胚胎－胚胎移植－新个体改良动物品种，拯救濒危动物难度大,成活率低利用植物激素进行育种适宜浓度的生长素可以促进果实的发育在未受粉的雌蕊柱头上涂抹一定浓度的生长素类似物溶液，促进子房壁发育成无子果实可得到无子果实该变异类型是不遗传的P抗病、黄果ssrr×易感病、红果SSRRF1易感病、红果肉SsRr↓第1年第2年↓×F29S_R_3S_rr3ssR_1ssrr抗、红连续自交ssRR抗病、红果肉F3F6第3~6年通常从F2开始选种，因为从F2开始发生性状分离实例：用辐射方法培育“黑农五号”大豆品种用X射线、紫外线照射等方法培育高产青霉菌株太空育种（利用宇宙射线进行空间诱变育种）单倍体育种过程第一年第二年染色体加倍花药离体培养单倍体植株正常植株（纯合体）新植株（新品种）秋水仙素处理筛选发育二（多）倍体植株1．为什么以一定浓度的秋水仙素溶液滴在二倍体西瓜幼苗的芽尖?西瓜幼苗的芽尖有丝分裂旺盛，用秋水仙素处理有利于抑制纺锤体的形成，从而形成四倍体植株。2、为什么三倍体高度不育？奇数的同源染色体不能正常联会，所以形成有一个完整的染色体组的配子的机率很低。3、为什么还要给三倍体植株授粉？为了获得生长素，刺激子房发育4、三倍体生长发育慢，且高度不育，如何留种、扩大生产？组织培养、营养繁殖基因工程的概念限制性核酸内切酶1.来源：主要是从中分离纯化出来的。2.功能：能够识别双链DNA分子的某种核苷酸序列，并且使每一条链中部位的两个核苷酸之间的断开，因此具有性。特定原核生物特定磷酸二酯键特异作用结果：产生黏性末端或平末端GAATTCGCTTAAAATTCG限制酶切割DNA分子示意图CTTAAG黏性末端EcoRⅠCCCGGG限制酶切割DNA分子示意图GGGCCC平末端SmaⅠCCCGGGGGGCCC限制酶只能作用于DNA，不能作用于RNA不同的限制酶也可能切割得到相同的黏性末端切割目的基因和运载体时通常要求使用同一种限制酶1。分类：根据酶的来源不同，可分为两类：一类是从中分离得到的，称为连接酶；另一类是从中分离出来的，称为连接酶。基因的的针线——DNA连接酶大肠杆菌E.coliDNAT4噬菌体T4DNA2。两种DNA连接酶的比较：（1）相同点：都缝合键。（2）区别：E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的之间连接起来，而不能将双链DNA片段之间进行连接；而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的，又可以“缝合”双链DNA片段的。但连接平末端的之间的效率较。磷酸二酯黏性末端平末端黏性末端平末端低（3）连接的部位：磷酸二酯键（在“梯子”的扶手处），不是氢键（在“梯子”的踏板处）。运载体有哪些？应具备什么特点？常用的运载体主要有两类：1）质粒2）噬菌体衍生物或某些动植物病毒来源：细菌及酵母菌等生物本质：小型环状DNA分子特点：结构简单、能自我复制、有一个至多个限制酶切点、具有标记基因基因工程的操作流程：目的基因运载体重组DNA受体细胞转基因生物（1）目的基因的获取（2）基因表达载体的构建（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定如何获取目的基因？获取目的基因的方法有：①从自然界已有的物种中分离出来②通过DNA合成仪用化学方法人工合成③从基因文库中获取④利用PCR技术扩增目的基因⑤反转录法合成基因文库：含有不同基因的受体菌群。包括基因组文库和cDNA文库。条件：引物、模板、dNTP、Taq酶、缓冲液过程：高温变性、低温复性、适温延伸RNA→DNA逆转录酶1.什么是基因文库？种类基因组文库：cDNA文库：含有一种生物的全部基因含有一种生物的部分基因（1）从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。PCR技术扩增目的基因的过程：PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，断裂，形成______b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链（二）基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因基因表达载体的组成包括哪些部分？①复制是从DNA分子上的特定位置开始的,这一位置叫复制原点②启动子是基因的一个组成部分，是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列③终止子是DNA分子中终止转录的核苷酸序列将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞（Ca2+处理法）农杆菌转化法农杆菌：生活在土壤中。能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物无感染能力。过程：构建表达载体（重组Ti质粒）转入农杆菌导入植物细胞目的基因插入植物细胞染色体DNA中培养再生成植株筛选出表现新性状的植株将目的基因导入植物细胞之显微注射技术2.将目的基因导入动物细胞之将含有目的基因的表达载体提纯(浓度1-3%ug/mL)取卵显微注射人工受精将受精卵移入子宫感受态细胞3、将目的基因导入微生物细胞：(A)常用的受体细胞：大肠杆菌(最广泛)、枯草杆菌、土壤农杆菌(B)导入途径：受体细胞(细菌)CaCl2处理细菌细胞壁通透性增加感受态细胞与重组质粒混合感受态细胞吸收重组质粒主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞方法原因：繁殖快，单细胞，遗传物质少。（-4℃）因为大肠杆菌等细菌的细胞壁成分主要是肽聚糖，因此一般要先用Ca2＋处理，以增加细菌细胞壁的通透性。思考：为什么要用Ca2＋处理细胞？分子水平的检测个体水平鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等——DNA分子杂交技术——分子杂交技术——抗原—抗体杂交8、如何进行目的基因的检测和鉴定？给虫喂食转基因植物的叶片，观察虫是否死亡用相应的病菌感染转基因生物，观察该个体是否感病将转基因生物培养在相应的环境中，观察个体是否存活（观察杂交后是否出现杂交带）9、（DNA）分子杂交技术的原理是什么？——碱基互补配对原则原理基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗的目的。（导入外源基因后，病人体内的缺陷基因仍然存在）基因诊断（检测）：运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测病毒感染及遗传缺陷。10、举例说明转基因植物的生产流程（如抗虫棉的培育）（苏云金杆菌）抗虫基因（农杆菌Ti质粒）T-DNA重组质粒农杆菌导入导入DNA连接酶（双子叶、裸子植物）组织细胞基因工程脱分化愈伤组织再分化胚状体转基因植物植物组织培养技术含有外源基因的植物可看做是杂合子，通过杂交、自交等手段可获得纯合的转基因植物11、举例说明转基因动物的生产流程（如利用转基因动物生产药物）药用蛋白基因乳腺蛋白基因的启动子等调控组件基因表达载体显微注射法受精卵基因工程早期胚胎体外胚胎培养胚胎移植代孕母体转基因动物胚胎工程雌性动物分泌的乳汁中含有药用蛋白乳腺生物反应器12、举例说明转基因工程菌的生产流程（如利用大肠杆菌生产人的胰岛素）（1）常选择大肠杆菌等原核生物作为基因工程受体细胞的原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少（2）过程：人的胰岛素基因细菌质粒重组质粒Ca2+大肠杆菌细胞壁的通透性增大（感受态细胞）重组质粒与感受态细胞混合，并促进感受态细胞吸收DNA分子目的基因随受体细胞的繁殖而复制在大肠杆菌中合成的人的胰岛素没有活性，需经过加工、激活。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。1.概念：第二代基因工程——蛋白质工程2.基本原理：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列→创造自然界不存在的蛋白质。3.蛋白质工程的前提条件：4.蛋白质工程的关键技术：了解蛋白质的结构和功能的关系基因工程5.蛋白质工程的目的：定向改造天然蛋白质，创造自然界不存在的蛋白质6.蛋白质工程的实质：对编码蛋白质的基因进行改造细胞工程指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。应用的原理和方法研究的水平研究的目的细胞生物学和分子生物学细胞整体水平或细胞器水平按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品(定向改造）细胞工程植物细胞工程植物组织培养植物体细胞杂交动物细胞工程植物组织培养的概念：在无菌和人工控制的条件下将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予一定的培养条件，诱导产生愈伤组织和胚状体，最终形成完整的植株。愈伤组织根、芽植物体脱分化再分化一、植物组织培养（分化）外植体（离体的,已分化组织或细胞）幼芽或幼根？条件？（未分化）特点？①适宜温度、pH和无菌环境、无光。②无机物、有机物和植物激素（生长素，细胞分裂素等），琼脂无定形状态薄壁细胞高度液泡化排列疏松、无规则无叶绿体,不进行光合作用分化程度低脱分化较易理论基础：细胞的全能性无机营养成分：无机盐离子有机营养成分：①含N物质：包括维生素和氨基酸②碳源：2%—5%的蔗糖溶液，调节渗透压③琼脂：起支持作用④激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素PH值：5.0－6.0细胞的全能性1.概念:已高度分化的细胞仍具有发育成完整个体的潜能。2.原因：生物体细胞含有本物种所特有的全套遗传信息。3.全能性高低：①受精卵＞胚胎干细胞＞生殖细胞＞体细胞②植物细胞＞动物细胞1、植物细胞表现出全能性的条件有哪些？2、在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？3、为什么切取胡萝卜根的形成层，其他部分也能培养成小植株吗？细胞离体、一定的营养物质、激素和其他外界条件。避免杂菌在上面迅速生长消耗营养，且有些杂菌会危害培养物的生长。想一想形成层更容易诱导成愈伤组织，其他部分如叶、花也能培养成小植株，只是稍微困难些。4、脱分化和再分化对光照有什么要求？为什么？5、决定植物脱分化、再分化的关键因素是什么？6、请同学们根据上述过程概括出植物组织培养技术的流程图，并与同学交流。脱分化避光，因为避光更易形成愈伤组织。再分化需要光照来合成叶绿素。植物激素。当生长素含量高于细胞分裂素时，有利于根的形成。当生长素含量低于细胞分裂素时，有利于芽的形成。离体的器官、组织或细胞脱分化再分化愈伤组织根和芽完整植株发育激素、避光激素、光照1、定义：将两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的过