高效液相色谱基础知识.

1第一节岛津LC-10AT型HPLC操作规程2目的:规范岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。范围:适用于岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。职责:质检员对本规程的实施负责。3一、系统组成本系统由2个LC-10ATvp溶剂输送泵（分主/A泵和副/B泵）、Rheodyne7725i手动进样阀、SPD-10Avp紫外-可见检测器、N2000色谱数据工作站和电脑等组成，另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。4二、准备1、准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气20min。2、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。3、配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45μm滤膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）4、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。5接通电源，依次开启不间断电源、B泵、A泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。三、开机6四、参数设定1、波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按[func]键，用数字键输入所需波长值，按[Enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕。2、流速设定：在A泵显示初始屏幕时，按[func]键，用数字键输入所需的流速（柱在线时流速一般不超过1ml/min），按[Enter]键确认。按[CE]键退出。3、流动相比例设定：在A泵显示初始屏幕时，按[conc]键，用数字键输入流动相B的浓度百分数，按[Enter]键确认。按[CE]键退出。7四、参数设定4、梯度设定：4.1：在A泵显示初始屏幕时，按[edit]键，[Enter]键；4.2：用数字键输入时间，按[Enter]键，重复按[func]键选择所需功能（FLOW设定流速，BCNC设定流动相B的浓度），按[Enter]键，用数字键输入设定值，按[Enter]键；4.3：重复上一步设定其它时间步骤；4.4：用数字键输入停止时间，重复按[func]键直至屏幕显示STOP，按[Enter]键。按[CE]键退出。8五、更换流动相并排气泡1：将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；2：逆时针转动A/B泵的排液阀180°，打开排液阀；3：按A/B泵的[purge]键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速冲洗，3min（可设定）后自动停止；4：将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。5：如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。6：如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下连接管，放入废液瓶中，设流速为5ml/min，按[pump]键，冲洗3min后再按[pump]键停泵，重新接上柱并将流速重设为规定值。9六、平衡系统1、查看基线：1.1：按《N2000色谱数据工作站操作规程》打开“在线色谱工作站”软件，1.2：输入实验信息并设定各项方法参数后，1.3：按下“数据收集”页的[]按钮。10六、平衡系统2、等度洗脱方式2.1：按A泵的[pump]键，A、B泵将同时启动，pump指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。2.2：检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。2.3：观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再操作。2.4：观察基线变化。如果冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为0.001mV时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。11六、平衡系统3、梯度洗脱方式3.1：以检验方法规定的梯度初始条件，按2项下方法平衡系统。3.2：在进样前运行1~2次空白梯度。方法：按A泵的[run]键，prog.run指示灯亮，梯度程序运行；程序停止时，prog.run指示灯灭。12七、进样1、进样前按检测器[zero]键调零，按软件中[零点校正]按钮校正基线零点，再按一下[查看基线]按钮使其弹起。2、用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量即可以进样了。3、含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次。13八、谱图的判断及结果计算系统适用性实验：三个重要指标①分离度（加强）：一般应≥1.5。②重复性：两次谱图的峰面积应相差不的过1%。③理论塔板数：应≥规定的理论塔板数目。④拖尾因子：0.95＜T＜1.05⑤保留时间：对照与样品的主成分保留时间应大致一致。⑥RSD：＜3%14八、谱图的判断及结果计算1、内标法用含对照品和内标物质的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式算出校正因子（f）：其中As和Ar分别为内标物质和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别为加入内标物质和对照品的量。15八、谱图的判断及结果计算2、外标法：①用含对照品的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式计算比值（r）：r=mr/Ar（其中mr和Ar分别为对照品的量和相应的峰面积或峰高。）②再根据供试品溶液的色谱峰响应值，计算供试品中被测成分的含量（mi）：mi=r×Ai（其中Ai为供试品溶液中被测成分的峰面积或峰高）。③必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成标示量的百分含量，或根据稀释倍数、取样量折算成百分含量。16九、清洗管路及进样口1、分析完毕后，先关检测器和数据处理机，再用经滤过和脱气的适当溶剂清洗色谱系统，正相柱一般用正已烷，反相柱如使用过含盐流动相，则先用水，然后用甲醇-水冲洗，冲洗前先按（4.1.1~4.1.2）操作，再用分析流速冲洗，各种冲洗剂一般冲洗15~30分钟，特殊情况应延长冲洗时间。17九、清洗管路及进样口2、冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵，进样器也应用相应溶剂冲洗，可使用进样阀所附专用冲洗接头。3、关断电源，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱柱、流动相、柱压，使用小时数，仪器完好状态等。18【特殊情况】：谱流路系统，从泵、进样器、色谱柱、到检测器通池，在分析完毕后，均应按（5.1）充分冲洗，特别是用过含盐流动相的，更应注意先用水，再用甲醇-水，充分冲洗。九、清洗管路及进样口19谢谢大家！20第二节岛津LC-10AT型HPLC注意事项21一、流动相1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；3、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。22二、样品1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；3、手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；23三、色谱柱1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；2、使用符合要求的流动相；3、使用保护柱；4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。24三、色谱柱5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；6、不要高压冲洗柱子；7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；使用过程中注意轻拿轻放。25四、操作过程1、开机操作：（1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开BootpServer（一般启动时已打开）；（2）、自上而下打开个组件电源，BootpServer里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开Online）；（3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；26四、操作过程（4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；（5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。27四、操作过程2、先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；3、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；28四、操作过程4、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；5、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；29四、操作过程6、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭D灯、W灯；7、关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；30四、操作过程8、使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。未经操作培训，不得擅自使用仪器。31自己总结的12条注意事项以下12条注意事项是自己在安装和使用液相色谱仪中的经验得出的，可能存在某些片面性，如有不当之处请多提宝贵建议。321、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。2、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。333、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。4、使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。345.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂(如甲醇)等清洗进样器。357.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法：①以异丙醇作溶剂冲洗；②放在异丙醇中间用超声波清洗；③用10％稀硝酸清洗。。369.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。3711.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。38谢谢大家！39第三节高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法40一、保留时间变化1.柱温变化2.等度与梯度间未能充分平衡3.缓冲液容量不够4.柱污染5.柱内条件变化6.柱快达到寿命1.柱恒温2.至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.用25mmol/L的缓冲液4.每天冲洗柱5.稳定进样条件,调节流动相6.采用保护柱41二、保留时间缩短1.流速增加2.样品超载3.键合相流失4.流动相组成变化5.温度增加1.检查泵,重新设定流速2.降低样品量3.流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温42三、保留时间延长1.流速下降2.硅胶柱上活性点变化3.键合相流失4.流动相组成变化5.温度降低1.管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温43四、出现肩峰或分叉1.样品体积过大2.样品溶剂过强3.柱塌陷或形成短路通道4.柱内烧结不锈钢失效5.进样器损坏1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.采用较弱的样品溶剂3.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.更换进样器转子44五、鬼峰1.