高效液相色谱法测定大豆提取物中大豆异黄酮的含量

高效液相色谱法测定大豆提取物中大豆异黄酮的含量【摘要】奉文建立了大豆提取物中大豆异黄酮酌高效液相色谱测定方法．通过正变试验确定了样品水解。最佳条件为：1．0tool／1HC1一MeOH溶解、80~C下、回流水解0．5h．采用Nova—PakClB3．9×150mm4ktm色谱枉，MeOH—O．4％PO4(47：53V／V)为流动相，流速0．7ml／min，检测波长260n111等色谱条件下洲定甙元含量。通过换算因子计算大豆异黄酮的含量。该方法快速、灵敏、重现性好，回收率达99％，变异系数小于3％。为产品的进一步开发研究打下了盘好基础。【关键词】大豆提取物；大豆异黄酮；墨兰丝；正变设计法；方差分析；高效液相色谱法0.前言大豆由于富含多种生物活性物质，一直是人们关注的热点。随着现代研究的不断深入，大豆异黄酮防治心脑血管疾病，预防乳腺癌和骨质疏松症，改善更年期症状等作用逐步被人们所认知。目前，国内已有十多家企业对其进行研究、生产，但检测方法各异。采用测定黄酮化合物的比色分析法，样品中有其他色素的干扰；紫外分光光度法虽然方便、快速，但不能测定单一成分，且样品处理不当会有杂质干扰。鉴于此，有必要研究一种可靠的大豆异黄酮的含量检测分析方法。大豆异黄酮是多酚类混合物，大豆异黄酮的组成、存在形式主要包括染料术素(gnistein)、大豆黄素(daidzeln)和黄豆黄素(glyeitein)，天然情况下它们主要以7—0一葡萄糖甙形式存在。本文对大豆提取物中异黄酮含量的高效液相色谱测定方法进行了系统的研究，并对样品的前处理条件进行探讨。为产品的进一步开展研究打下了良好的基础。l.试验材料与方法1．1仪器高效液相色谱仪,25µL微量注射器,M-50型微孔滤膜，超声波清洗器1．2试剂与材料对照品大豆黄素、染料木素、黄豆黄素由本实验室分离制备。甲醇：色谱纯试剂。水：自制，二次重蒸；其余试剂均为分析纯。标准溶液：准确称取对照品大豆黄素、染料木素、黄豆黄素各10mg，加入100rid容量瓶中，以甲醇溶解，定容至刻度，作为标准储备液。大豆提取物：本实验室研究提取。1．3色谱条件色谱柱：Nova—PakC183．9×150mm4µm(Waters公司)流动相：分析甙元用流动相MeOH：0．4％H3P04：55：45(v／v)；流速0．7ml/min分析甙元用流动相MeOH：0．4％P04=30：70(v／v)；流速0．7ml/min柱温：25℃检测波长：260nm1．4分析方法1．4．1标准曲线绘制精密吸取一定体积的标准储备液，配制成不同浓度的标准溶液，进样分析，测定各组分的峰面积，绘制标准曲线。1．4．2样品处理准确称取大豆提取物样品20mg，加1.0mol/L盐酸甲醇溶液加40ml，于8O℃水浴中回流水解0．5h，冷却并定容至100ml，摇匀后供液相色谱分析。测定水解后组分的峰面积，计算大豆异黄酮的含量(染料木素、大豆黄素、黄豆黄素与其相应甙的换算因子分别为：1．60。1．64．1．54)。2.结果与讨论2．1色谱条件选择以大豆提取物中主要成分的水解产物染料木素、大豆黄素和黄豆黄素相互间基本分离为指标，确定色谱分离条件。从图l，2可见，实验中采用Nova—PakC183．9×150nm4pm色谱柱，以MeOH：0．4％H3P04=55：45(v／v)作为流动相分析甙元，流速采用0．7rot／rain，大豆黄素与黄豆黄素问分离度达1．18，染料木素为独立峰，以MeOH：0．4％H3PO4：37：70(v／v)作为流动相分析甙，大豆黄素甙与黄豆黄素甙间分离度达1．32，染料木素甙为独立峰，两种流动相的选择均比较合适。0．4％H3PO4的加入可有效改善色谱峰的分离。2．2线性关系分析准确移取标准储备液0.5、1．0、2．0、4．0、8．0ml并分别定容至10ml；准确吸取l0µL溶液进样，以峰面积(y)与组分浓度(x)进行线性回归分析，得到回归方程依次为：大豆黄素y=582450x-198，r=0．9998；黄豆黄素y=805610x-298，r：0．9998；染料木素y=979340x-107，r：0．9996。线性范围分别为2．60—83．2µL/ml、2．088—66．8µL/ml、2．388—76．4µL/ml.2．3样品预处理条件探讨大豆提取物中主要成分以7—0一葡萄精甙形式存在，但由于甙的对照品不易提纯获得，而甙元对照物制备及提纯相对容易，因而在测定过程中可以用甙元作为对照品，样品可经水解后分析，再经换算为大豆异黄酮的含量。染料木素、大豆黄素、黄豆黄素与其相应甙的换算因子分别为：1．60，1．64，1．54。对影响样品水解条件的主要因素(酸浓度、水解时间、水解温度等)进行三因素3水平正交试验，确立样品分析时的最佳处理条件，以总异黄酮含量测定结果为试验指标。见表1和表2。由表3可见，影响样品水解的主要因素为盐酸的浓度及水解温度，水解时问影响不大，将水解时问因素合并到误差项中，重新列出方差分析表，见表4。由表3，4可见水解时盐酸的浓度对样品水解有显著影响，水解温度的影响极为显著。由表3看，K2AK3AK1A，K3BK2BK1B，K3CK1CK2C，由图1、3可见样品水解后只存在甙元峰，甙的峰已经消失。因此水解时优化条件为：盐酸的浓度lmol／1，水解温度8O℃，水解时问1h。2．4回收率试验准确吸取一定量对照品标准储备液加入样品中，与样品一同水解后，定容至100m]．，进行色谱分析，测定结果见表5。2．5精密度试验精密称取8份同批大豆异黄酮提取物样品，水解后测定其含量分别为25．1％、25．3％、24．8％、25O％、25．3％、24．9％、25．O％、25．1％，平均值为25.1％，精密度(RSD)为O．71％。3.结论本文采用酸水解样品后以HPLC法测定大豆提取物中甙元(染料术素、大豆黄素、黄豆黄紊)含量，再经换算为大豆异黄酮的含量。本方法的提出，解决了直接测定时需要标准品种类多、分离困难、分析时问长等缺点，方法简便、快速，分离效果好。样品在1．0raol／1盐酸甲醇溶液中，7O下回流水解1h后测定，以7—0一糖甙形式存在的峰位消失，样品水解完全，回收率均大于99．O％(RSD≤3％)，符合分析方法要求。4.参考文献【1】MichaeINaira，eta1．J．AgFoodChem．Amioxideaiveandantihemolytiaofsoybeaniaoflavones，1976，24(6)：1174—1177【2】PatrlelaA．eta1．Phenolicantioxidantaofd|iedsoybeans，J.ofFoodScience，1978，43：556—559【3】DanePratt，etalSourceofantioxidantactivityofsoybeansandsoyproducts，JofFoodScience，1979，44：1720—1722【4】江苏新医学院编写．中药太辞典上海：上海人民出版社，1977：2045．2382【5】毛峻琴，密鹤呜．大豆异黄酮的研究进展，中草药2003，31(1)61—63【6】K．R．马卡姆，黄酮类化合物结构鉴定技术.北京：科技出版社，1990：21—30，36—39，42—56【7】FrankeA.A，etal.RapidHPLCanalysisofdietaryphytoestrgensfromlegumesandfromhumanurine．Proc.Soc.Exp.Med．1995，208(1)：l8—26【8】BarnesKA，etal.AmicroboneHPLC/ESI-MSmethodforthedeterminationofthephytoestrgesgenisteinanddaidzeinincomminutedbabyfoodsandsoyaflour，RapidCommun．MassSpectrom，1998，12(3)：130一138【9】KinoshitaE，eta1.DifferentiationofsoysaucetypesbyHPLCprofilepatternrecognition.Isolationofnovelisoflavones.Advexpmepboil．1998,439：117—129