高级植物生理实验报告

高级植物生理实验报告植物营养生理1、植物组织氨态氮含量的测定2、硝酸还原酶活性的测定3、硝态氮含量的测定2014年12月22日植物组织氨态氮含量的测定（改良的茚三酮比色法）一、实验原理植物吸收的氮主要是氨态氮和硝态氮，后者经过还原过程形成氨，前者经同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸，然后形成其他氨基酸和蛋白质。测定氨态氮的方法有多种，本实验为改良的茚三酮比色法。α-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热，经氧化脱氨变成相应的α-酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮则被还原，在弱酸环境中，还原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反应，缩合生成蓝紫色物质。根据蓝紫色的深浅，在580nm波长下测定吸光值。本实验中在茚三酮试剂中添加乙二醇并补加正丁醇和丙醇，可以克服茚三酮的不稳定性。二、仪器设备研钵、烧杯、漏斗、量筒、具塞试管、三角瓶、容量瓶、移液管、天平、沸水浴锅、可见分光光度计三、试剂1.10%醋酸(100mL)2.1%抗坏血酸（100mL）3.5μg/mL亮氨酸或丙氨酸溶液（0.005g定容至1000mL）4.pH5.4醋酸缓冲液：8.8mL0.2mol/L醋酸（冰醋酸11.55mL稀释至1000mL）加41.2mL0.2mol/L醋酸钠（醋酸钠16.4g或三水醋酸钠27.2g配成1000mL）。5.水合茚三酮试剂：1.1g茚三酮放到烧杯中，加入15mL正丙醇，摇匀，溶解，后加入30ml正丁醇和60ml乙二醇，混匀，再加9mLpH5.4醋酸缓冲液，混匀。保存于棕色瓶中，冰箱保存，适用期限10天。四、操作步骤1.标准曲线的绘制以下表所示量从5μg/mL亮氨酸或丙氨酸溶液中分别取溶液并在每个试管中加蒸馏水至2mL，对照仅加2mL蒸馏水，后在各试管中加入3mL水合茚三酮试剂和0.1mL1%抗坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟，取出后搅拌冷却15分钟。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL，在波长580nm处测吸光值，以氨态氮浓度（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。试管号1234567试剂（mL）00.20.40.81.21.61.8氨态氮浓度00.512345（μg/mL）2.称取0.5g新鲜植物材料，放入研钵中，加入5mL10%醋酸，研磨后以蒸馏水稀释至100mL，混匀，通过滤纸过滤，弃去最先滤下的一部分滤液后过滤到100mL三角瓶中。3.从剩下的滤液中取2mL放入试管中，加3mL水合茚三酮试剂和0.1mL1%抗坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟。同时将盛有对照溶液（提取液用蒸馏水代替）的试管加热。4.取出后搅拌冷却15分钟。加热形成的红色茚三酮试剂被氧氧化而褪色，茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色反应产物仍然存留并变得更加鲜明。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL，混匀。在波长580nm处测光密度值，根据标准曲线查得数值代入以下公式计算氨态氮含量。（0.1×10×C）X（100g样品中的氨态氮毫克数）=×100（2×n）C：比色液中氨态氮浓度（μg/mL）10：比色液体积（mL）n：样品重量（g）100：分析溶液总体积（mL）0.1：μg换算成mg并折算成100g物质中含量的换算系数。标准曲线：0.72=0.0249*C+0.0599C=26.85（0.1×10×C）X=×100=2685mg（2×n）硝酸还原酶活性的测定一、目的硝酸还原酶（NR）是硝酸盐同化过程中的关键酶，在植物生长发育中具有重要作用。测定硝酸还原酶的活力，可作为作物育种和营养诊断的生理生化指标。一、原理硝酸还原酶（NR）催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对氨基苯磺酸（或对氨基苯磺酰胺）发生重氮反应，生成的重氮化合物又与α-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下生成红色偶氮化合物，反应如下：NRNO3-+NADH+H+NO2-+NAD++H2O生成的红色偶氮化合物在520nm下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。亚硝酸盐的生成量与硝酸还原酶的活性呈正相关。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：马铃薯块茎（二）仪器设备分光光度计，电子天平，真空抽气泵，真空干燥器，恒温箱，50mL三角瓶，试管，移液管，剪刀（三）试剂及配制1.亚硝酸钠标准液：精确称取亚硝酸钠0.1g，溶于蒸馏水后定容至100mL，吸取此液0.5mL定容至100mL，即为5μg/mL的亚硝酸钠标准液。2.0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O15.0453g与NaH2PO4·2H2O1.2483g加无离子水溶解后定容至500mL。3.0.2mol/LKNO3溶液:称取10.11gKNO3溶于磷酸缓冲液并定容至500mL。4.1%磺胺（对氨基苯磺酰胺）溶液：称取1g对氨基苯磺酰胺加25mL浓盐酸，用蒸馏水定容至100mL。5.0.2%α-萘胺溶液：称0.2gα-萘胺，加25mL冰乙酸，用蒸馏水定容至100mL。6.30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸用水定容至100mL。四、实验步骤1.标准曲线的制作取6支试管，编号，按表1加入试剂：表1标准曲线制作取样表试剂试管号012345亚硝酸钠标准液(mL)蒸馏水(mL)1%磺胺试剂(mL)0.2%α-萘胺(mL)每管亚硝酸钠含量(μg)00.40.81.21.62.02.01.61.20.80.404.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.00246810摇匀后在室温下放置20分钟，然后在520nm波长下测定吸光值，以亚硝酸钠含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。2.酶活性的测定将实验材料洗净，再用蒸馏水冲洗一遍，用滤纸将水吸干，切成0.5cm×0.5cm左右的小块，混合均匀后分别称取三份，每份1g，分别置于50mL三角瓶中，编号，按表2中加入各试剂。表2酶活性测定取样表瓶号1230.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液(mL)4.04.04.00.2mol/LKNO3溶液(mL)5.05.05.030%三氯乙酸(mL)1.000摇匀后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气10分钟。放气后摇匀再抽10分钟，样品沉入溶液中。将三角瓶取出置于恒温箱中30℃暗条件下30分钟。取出后立即向2、3号瓶内分别加入1mL30%三氯乙酸以终止酶反应。将各瓶中的反应液在2000r/min下离心10分钟，分别取上清液2mL于另一试管中，各加入4mL1%磺胺试剂后再加4mL0.2%α-萘胺,室温显色20分钟后以不加酶液的（用2mL蒸馏水代替）作为空白对照测定吸光值。2、3号管吸光值平均值减去1号管吸光值，所得数值在标准曲线上查得相应的亚硝酸钠含量。三、结果与计算将在标准曲线上查得的亚硝酸钠含量代入下式，计算硝酸还原酶活性：亚硝酸钠含量(μg)×稀释倍数NR活性[NaNO2(μg)·g-1FW·h-1]=样品鲜重(g)×酶反应时间(h)结果：标准曲线：吸光值ABS=（0.039+0.045）÷2-0.020=0.0210.021=0.0684x-0.008x=0.42μgNR活性=0.42μg×200÷(1g×5/6h)=100.8(μg)·g-1FW·h-1植物体内硝态氮含量的测定一、原理在浓酸条件下，ＮＯ３－与水杨酸反应，生成硝基水杨酸。生成的硝基水杨酸在碱性条件下（ｐＨ１２）呈黄色，最大吸收峰在波长４１０ｎｍ处，可直接比色测定。二、仪器和设备分光光度计、天平、刻度试管、移液器、移液管、容量瓶、漏斗、水浴锅、滤纸三、试剂1.500mg/LＮＯ３－-N标准溶液：称取KNO30.3611g溶于蒸馏水中，定容至100mL。2.5%水杨酸-硫酸溶液：称取5g水杨酸溶于100mL浓硫酸中，搅拌溶解后，贮藏于棕色瓶中。3.8%NaOH溶液：8.695gNaOH溶于100mL蒸馏水中。四、方法1.标准曲线的制作（1）吸取500mg/LＮＯ３－-N标准溶液0,1,2,3,4,6,8mL分别放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，使之成为0、10、20、30、40、60、80mg/L的系列标准溶液。（2）吸取上述系列标准溶液0.1mL，分别放入刻度试管中，以0.1mL蒸馏水代替标准溶液作空白。再分别加入0.4mL5%水杨酸-硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20分钟后，再加入8%NaOH溶液9.5mL，摇匀冷却至室温。显色液总体积为10mL。（3）以空白作参比，在410nm波长下测定光密度。以ＮＯ３－-N浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线并计算出回归方程。2.硝酸盐的测定（1）样品液的制备：取2g植物材料切碎后放入刻度试管中，加入10mL蒸馏水，封口。置于沸水浴中提取30分钟，冷却，将提取液过滤到25mL容量瓶中，并反复冲洗残渣，最后定容至刻度。（2）样品液的测定：吸取样品液0.1mL分别放入刻度试管中，加入5%水杨酸-硫酸溶液0.4mL，混匀后置室温下20分钟，再慢慢加入9.5mL8%NaOH溶液，待冷却至室温后以空白作对照，在410nm波长下测定光密度值。在标准曲线上查得或用回归方程计算出ＮＯ３－-N浓度，再用以下公式计算其含量。ＮＯ３－-N含量（mg/g）=（D×样品液总量）/样品鲜重D：标准曲线上查得ＮＯ３－-N浓度（mg/L）结果：标准曲线：0.072=0.0049*D-0.0296D=20.75ＮＯ３－-N含量（mg/g）=（20.75mg/L×25×10-3L）/2g=0.26mg/g