高级生物化学

1、Meselson关于半保留复制的证明思想1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。他们将大肠杆菌放在含有15N标记的NH4Cl培养基中繁殖，使所有的大肠杆菌DNA被15N所标记，可以得到15N-DNA。由于15N-DNA的密度比普通DNA(14N－DNA)的密度大，在氯化铯密度梯度离心时，两种密度不同的DNA分布在不同的区带。然后将细菌转移到含有14N标记的NH4Cl培养基中进行培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂介细胞，用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法观察DNA所处的位置。在重培养基中培养出的（15N）DNA显示为一条重密度带。转入轻培养基中繁殖两代。第一代所有DNA的密度介于15N-DNA和14N－DNA之间，即形成了DNA分子的一半含有15N，另一半含有14N的杂合分子。第二代后，14N分子和14N-15N杂合分子等量出现。若在继续培养，可以看到14N－DNA分子增多。当把14N-15N杂合分子加热时，它们分开成14N链和15N链。这就充分证明了。在DNA复制时原来的DNA分子可被分成两个亚单位，分别构成子代分子的一半，这些亚单位经过许多代复制仍然保持着完整性。由此可以证明大肠杆菌的复制遵循预想中的半保留复制方式。2、尼伦伯格对于遗传密码的破译思想1961-1962年，尼伦伯格和马太采用了蛋白质的体外合成技术，破译了第一个遗传密码：（1）实验思路：利用蛋白质的体外合成技术，以人工合成的RNA作模板合成多肽，确定氨基酸与密码子的对应关系。（2）实验步骤：1）提出大肠杆菌的破碎细胞液加入试管（除去原DNA和mRNA）2）添加20种氨基酸（分五组，每个试管各加四种氨基酸）3）加入人工合成的RNA（多聚尿嘧啶核苷酸）4）合成多肽（只在加入酪氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸的试管中出现多肽链）5）运用同样方法将上述四种氨基酸分别加入装有多聚U的四个试管（加入苯丙氨酸的试管中出现多肽链）（3）实验结论：尿嘧啶的碱基序列可编码由苯丙氨酸组成的多肽链，结合克里克提出的三个碱基编码一个氨基酸的实验结论，可以得出苯丙氨酸的密码子是UUU。3、真核mRNA和原核mRNA的区别对翻译过程的影响原核生物mRNA半寿期很短。真核生物mRNA的半寿期较长。原核生物mRNA常以多顺反子的形式存在。真核生物mRNA一般以单顺反子的形式存在。原核生物mRNA无5′端帽子结构和3′端聚腺苷酸尾巴，中间是蛋白质的编码区，一般编码几种蛋白质。真核生物mRNA（细胞质中的）一般由5′端帽子结构、5′端不翻译区、翻译区（编码区）、3′端不翻译区和3′端聚腺苷酸尾巴构成分子中除m7G构成帽子外，常含有其他修饰核苷酸，如m6A等。真核生物mRNA通常都有相应的前体。从DNA转录产生的原始转录产物可称作原始前体（或mRNA前体）。一般认为原始前体要经过hnRNA核不均-RNA的阶段，最终才被加工为成熟的mRNA。原核生物基因组中相关功能的基因常组成操纵子，作为一个转录单位，转录产生多顺反子mRNA。在多顺反子mRNA中有多个基因的编码区，各编码区为一开放阅读框架，可以翻译出多种蛋白质。各编码区5’端有起始密码子AUG或GUG，3’端有终止密码子UAA、UAG、UGA。原核生物mRNA含有SD序列，可以将30S核糖体小亚基结合在邻近mRNA起始密码子的特定位置，帮助核糖体正确识别起始密码子，与蛋白质合成起始密切相关。原核生物基因并不组成操纵子，通常转录产生单顺反子mRNA。真核生物mRNA5’端有甲基化的“帽”结构与蛋白质合成起始有关，3′端带有约200个腺苷酸的poly（A）尾巴和加尾信号序列——AAUAAA。真核生物mRNA没有SD序列，在5’和3’非翻译区存在调控序列，可以结合各种调节因子调控蛋白质的翻译过程。5’端起始密码子AUG附近存在不同的具有调节作用的茎环结构，3’非翻译区含有调节因子结合位点和mRNA的定位信号序列。4、点突变、移码突变对基因表达产物有什么影响点突变对基因表达产物的影响取决于它的位置和具体的变换方式。如果发生在垃圾DNA上，可能不会产生任何后果；如果发生在一个基因的启动子或者其他调节控制基因表达的区域，则可能会改变基因表达的效率；如果发生在一个基因的内部，情况就比较复杂，一方面取决于突变基因是蛋白基因还是非蛋白基因，另一方面如果是蛋白基因，则取决于究竟发生在它的非编码区，还是编码区。如果突变发生在蛋白基因的非编码区，则可影响到该蛋白基因的转录、转录后加工和翻译等；如果发生在蛋白基因的编码区。则会有三种不同的后果：①突变的密码子决定同样的氨基酸，这样的突变对蛋白质的结构和功能不会产生任何的影响，因此被称为沉默突变。②突变的密码子决定不同的氨基酸，这样的突变可能对蛋白质的功能不产生任何的影响或影响微乎其微，也可能产生灾难性的后果而带来分子病。由于突变导致出现了错误的氨基酸，因此，这样的突变被称为错义突变。如果错误的氨基酸与原来的氨基酸是同种性质，这种突变被称为中性突变。③突变的密码子变为终止密码子或者相反，前者因为终止密码子的提前出现可导致一条多肽链被截短，被称为无义突变，后者则会加长一条多肽链，被称为加长突变。移码突变会导致阅读框架发生改变，致使插入点或缺失点下游的氨基酸序列发生根本性的改变，但也可能会引入终止密码子而使多肽链被截短。移码突变究竟对蛋白质功能有何影响，取决于插入点或缺失点与密码子的距离。离起始密码子越近，功能丧失的可能性就越大。5、mRNA转录后有哪些加工方式原核生物mRNA一般不需要加工，一经转录即可直接进行翻译。但有少数多顺反子mRNA需要通过核酸内切酶切成较小的单位，然后再翻译。真核生物：真核生物编码蛋白质的基因以单个基因为转录单位，但有内含子，需切除。信使RNA的原初转录产物是分子量很大的前体，在核内加工时形成大小不等的中间物，称为核内不均一RNA(hnRNA)。其加工过程包括：①5’端加帽子：在转录的早期或转录终止前已经形成。首先从5’端脱去一个磷酸，再与GTP生成5’，5’三磷酸相连的键，最后以S-腺苷甲硫氨酸进行甲基化，形成帽子结构。帽子结构有多种，起识别和稳定作用。②3’端加尾：在核内完成。先由RNA酶III在3’端切断，再由多聚腺苷酸聚合酶加尾。③内部甲基化：主要是6-甲基腺嘌呤，在hnRNA中已经存在。可能对前体的加工起识别作用。6、核酶的应用前景核酶一词用于描述具有催化活性的RNA,即化学本质是核糖核酸(RNA),却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子,有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多,有的能够切割RNA,有的能够切割DNA,有些还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。核酶是在对多种植物病毒卫星RNA及类病毒RNA的自我剪接研究中发现的，数量较少，常见于rRNA的内含子。核酶的具体应用（1）抗病治疗随着对核酶的深入研究，已经认识到核酶在遗传病，肿瘤和病毒性疾病上的潜力。比如，对于艾滋病毒HIV的转录信息来源于RNA而非DNA，核酶能够在特定位点切断RNA，使得它失去活性。（2）反义核酸技术反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。它包括反义RNA、反义DNA和核酶三大技术。反义核酶作为一种基因下向调节作用因子，在抑制一些有害基因的表达和失控基因的过度表达上发挥着重要作用。随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病的研究。（3）核酶在医学上的应用1、核酶抗肝炎病毒的研究目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）以及HDV作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。2、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)核酶1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV-Ⅰ基因表达，并在Ⅰ期临床实验中受到良好效果。3、抗肿瘤治疗核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA，抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。核酶技术面临的问题①核酶催化切割反应的可逆性问题②催化效率低，如何提高催化效率③寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞④使核酶在细胞内有调控地高效表达⑤增强核酶在细胞内的稳定性⑥对宿主的损伤问题有待进一步考察7、乳糖操纵子模型操纵子的结构：调节基因、启动子、操纵基因、结构基因。乳糖操纵子模型中一次排列着启动子、操纵基因和阻遏子三个结构基因，它们分别编码β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透过酶和β-半乳糖苷转移酶，三个基因受同一个基因控制。当没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。阻遏蛋白阻碍RNA聚合酶与启动子P的结合，阻止启动基因上的RNA聚合酶进行转录，这是一种负调节作用。当有乳糖存在时，乳糖与阻遏蛋白的边沟位点结合，使之发生变构而失去活性，因而不能与操纵基因结合，于是RNA聚合酶能够转录，产生上述三种酶，使大肠杆菌能利用乳糖。当培养基中有葡萄糖存在时，葡萄糖的降解产物能降低细胞内cAMP的含量，影响CAP与启动子结合，也影响RNA聚合酶与启动基因结合，因此，β-半乳糖苷酶等三种酶也不能产生。这是一种正调控作用。8、丝氨酸蛋白酶电荷转移网络是如何工作的丝氨酸蛋白酶是一个酶家族，是一类同源蛋白质。大多数丝氨酸蛋白酶具有相似的三维系统，都有一个天冬酸残基、一个组氨酸残基和一个丝氨酸残基，它们成串排列，并通过氢键网络成一个所谓催化三联体；在胰凝乳蛋白酶中它们是Asp102、His57和Ser195。丝氨酸蛋白酶在通常情况下是惰性的，但催化三联体的Ser处于非常的环境中，它紧挨着His；Ser羟基的质子可被转移到His的环N上，自身留下一个负电荷是Ser氧化成为更强的亲和剂。一般情况下，这种转移也是不可能的，但它被邻环的Asp102所促进，Asp102通过它的羧基负电荷稳定了His环的质子化。可见催化三联体在功能上起转移电荷的作用，因此它也称为电荷转移系统或电荷中继网。9、酶活性中心是如何让形成的，通常哪些基因出现在此上酶分子中能够直接与底物分子结合，并催化底物化学反应的部位，这一部位就成为酶的活性中心。一般认为活性中心主要由两个功能部位组成：第一个是结合部位，酶的底物靠此部位结合到酶分子上；第二个是催化部位，底物的键在此被打断或形成新的键从而发生一定的化学变化。组成功能部位的是酶分子中在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团，它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同肽链上，而是通过肽链的盘绕、折叠在空间构象上相互靠近；对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构也是功能部位的组成部分。基因：活性中心必需的基团有：组氨酸的咪唑基、谷氨酸天冬氨酸的侧链羧基和丝氨酸的羟基。10.别构酶的作用模型同构模型（MWC模型）：Monod，Wyman和Changeux于1965年提出的，又称齐变模型和对称模型。MWC模型要点：1.别构酶是由相同的亚基所组成的寡聚酶，他们在分子中对称排列2.每一个亚基对特定的配基都有一个等价的结合位点3.每个亚基都有两种不同的构型，既，松弛态R态（Relaxstate）和紧张态T态（Tensedstate）。R态结构松弛，对底物的亲和力较大，T态结构紧密，对底物的亲和力较小。4.酶分子中各个亚基都以相同的构型而存在，当其中的一个亚基与底物结合而产生构型的变化时，其他各个亚基也同时改变其构型，即两种构型（T和R）在酶分子中不共存。5.酶分子构型的改变不影响分子的对称性。6.T态和S态两种构型处于动态平衡状态，当有底物或变构激活剂存在时，平衡向R态移动，当没有底物或变构激活剂存在时，平衡向T态移动。序变模型（KNF模型）：Koshland，Nemethy和Filmer于1966年提出，又称序变模型。KNF模型要点：1.别构酶是由相同的亚基所组成的寡聚酶，他们在分子中对称排列。