黄曲霉素检测分析技术进展

黄曲霉毒素分析检测方法进展浙江工业大学海洋学院食安1201蔡婉静201206600102白鸣鸣201206600101摘要：黄曲霉素是一种具有极强致癌性的剧毒真菌毒素，它广泛存在于天然食品中。其中在天然食品中最常见的是黄曲霉素B1,其致癌性以及毒性是最强的。本文就黄曲霉素的分析检测方法作论述并进行分析比较，并进行展望，为该方向的研究提供一些参考。关键词：黄曲霉素；分析检测ProgressofAflatoxintestanddetectionAbstract:Aflatoxinisakindofstrongcarcinogenicvirulentfungustoxin,itwidelyexistsinthenaturalfood.AmongtheminthenaturalfoodthemostcommonformofaflatoxinB1,itscarcinogenicityandtoxicitywasthestrongest.Inthispaper,theanalysismethodofaflatoxinisdiscussedandanalyzed,toprovidesomereferenceforthedirectionofresearch.Keywords:aflatoxin;Analysisoftest黄曲霉素(aflatoxin，AFT)，主要是由寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、黄曲霉(Aspergillusflaw)、和集峰曲霉(Aspergillusnomius)产生的次生代谢产物，是一类真菌毒素。1993年世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构将其划定为一类致癌物，具有高毒性，世界将其与其他两种毒物并归为三大强致癌物质。它广泛地存在于自然食物中，土壤、动植物、各种坚果(特别是花生和核桃中)中，在天然存在的食物中其存在形式主要为B1，B1的致癌性以及毒性也是最强的。其毒性约为KCN的10倍，砒霜的68倍，致癌性约为二甲基亚硝胺的75倍，奶油黄的900倍，3，4一苯并芘的4000倍，人畜若是误食该毒素会引起内脏出血性坏死，慢性中毒甚至引发癌症。[1]我国的主要粮食作物大米以及玉米极易被黄曲霉毒素污染，而结晶的黄曲霉毒素B1的热稳定性较高，其分解温度为268℃左右，故烹调中的一般加热不能破坏黄曲霉毒素。[2]因此，能快速、有效地检测出食品中的黄曲霉毒素对于食品安全来说具有很重要的实际意义。1.黄曲霉毒素的分析检测方法目前测定食品中黄曲霉毒素主要采用高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）、液相色谱－质谱法（LC--MS）、光谱法、酶联免疫法和液相色谱－飞行时间质谱法（LC－Q－TOF）等。我国标准采用的是高效液相色谱法（HPLC）和薄层色谱法（TLC）测定食品当中的黄曲霉毒素B１含量。[3]1．1色谱法1．1.1高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法（HPLC）的原理是用高效液相色谱仪加柱后衍生系统分分离，用荧光检测器测定。该方法速度快、灵敏度高、准确性高，检测限值是目前所有方法中最低的，但其设备昂贵，且对工作人员身体健康有影响，若是与免疫亲和柱一起使用，则可降低对工作人员身体的影响，但检测费用会相对增加。[4]然而该方法最大的缺点是荧光检测器对黄曲霉毒素的四种分子具有选择性，它对黄曲霉毒素G2、B2的很灵敏，但对黄曲霉毒素G1、B1的灵敏性却不高。若想要提高B1、G1的荧光度，可以通过两种方法：1.改变流动相或者改进检测器来减少荧光度损失或者增加灵敏度2.采用柱前或者柱后衍生来增强其荧光度。文镜使用国产硅镁制作的吸附柱层析分离纯化玉米中的黄曲霉毒素B1，然后用高效液相色谱法分析检测其中的黄曲霉毒素。结果证明该方法检测最低限度可以达到0.08ng,回收率可以达到92.87%。该方法成本较低且制作方便。[5]MycoSep系列的多功能净化柱（MFC）可以用于霉菌毒素的分离纯化。该多功能净化柱可以用于HPLC的前处理净化，该方法可以一步完成净化过程，并且效果理想。[6]1.1.2薄层色谱法（TLC）薄层色谱法于1990年被列为AOAC标准方法，其原理是利用在样品中的黄曲霉毒素和其它物质在流动相和固定相中的分配系数不同将其分离，然后在365nm波长的紫外线激发下使黄曲霉毒素产生荧光，将该荧光与标准品的进行比较从而测定其含量[7]。在365nm下观察可发现，AFG1、AFG2、AFB1以及AFB2分别显绿色、蓝色、蓝紫色和蓝紫色。TCL的过程主要包括提取样品、柱层析、洗脱、薄层分离。现在的TCl的提纯、净化效果并不是非常理想，使得提取液中含有较多杂质从而影响斑点的荧光强弱。薄层色谱法设备简单，费用低，[8]因此目前国内粮油、一般食品所采用的检测方法都是薄层色谱法，但其前处理繁琐，提取以及净化效果并不是十分理想，灵敏度不高，并且对操作人员身体有害，因此此方法越来越不适合当前时代分析的要求。Tyihak在1979年提出了一种结合了高效薄层色谱法、高效液相色谱法以及经典薄层色谱法的优点的平面液相色谱技术——高压薄层色谱法（OPTLC）,它能显著提高薄层分离效率。而后又有人提出了适合专门检测小麦和玉米中的黄曲霉素的高压薄层色谱法。1．2免疫化学法免疫化学法是目前比较有效的检测黄曲霉毒素的方法。常用的方法包括金标免疫层析法（GICA）、酶联免疫法（ELISA）、免疫亲和柱法、微柱筛选法。[9]1.2.1金标免疫层析法（GICA）金标免疫层析法将色谱层析技术和胶体金免疫技术结合起来，其原理是利用样品中的黄曲霉毒素B1与胶体金颗粒表面的抗AFB1单克隆抗体反应，若黄曲霉毒素超标，胶体金颗粒表面不会再有剩余的抗体位点，它将不停留在检测线而继续上行与质控线上的羊抗鼠LgG反应，呈现红色。若样品中不含黄曲霉毒素或黄曲霉毒素含量未超标，则胶体金颗粒表面剩余的抗体会与检测线上的物质反应呈现红色。[10]Xiulan等合成了对一种对AFB1具有特异性的抗体金标探针，该探针结合免疫色谱法对AFB1进行分析所需最长时间仅10min，且最低检测限度可达到2.5ng/ml.该方法检测结果快速准确，因此十分适合快速检测以及大量样品的初选。[11]1.2.2酶联免疫法（ELISA）ELISA法是近年开发出的一种新方法，也是我国的国标方法之一。该法利用免疫、酶以及生化技术来检测黄曲霉毒素含量，其原理是利用抗原与抗体之间的特异性免疫反应来测定黄曲霉毒素含量，并通过测酶活力来增加检测的精确度。该发大致可以分为两类：一是双抗体夹心法，二是竞争法。该方法速度快，安全性高，精确度高。刘冬儿运用ELSA法对食品中的黄曲霉毒素进行测定，结果表明该方法检测灵敏度高达0.015μg/Kg,灵敏度比薄层色谱法提高300到400倍，回收率也高达89.2%。但是该方法的缺点是试剂保存期短且需在低温条件下保存，假阳性的概率比较高，对含盐以及脂肪量高的样品需进行额外处理。1.2.3免疫传感器法免疫传感器又称免疫电极，是与测定抗原抗体反应有关的一类传感器的统称。传感器主要有电化学免疫传感器、压电免疫传感器、光电免疫传感器。免疫传感器操作简单、速度快、灵敏度高、成本低廉，在近年的研究中越来越得到重视。[12]1.2.4管式磁微粒化学发光免疫分析法该法原理是使被辣根过氧化酶标记的AFB1、AFB1与被FITC标记的AFB1单克隆抗体在均相体系中发生竞争性免疫反应。而后加入被抗FITC包被的微磁粒使之与抗原抗体复合物结合，在磁场中分离洗涤后加入发光物质，再通过用冷光分析仪测其发光强度来检测AFB1含量。郑国金[13]等人已经成功将该方法用于检测玉米样品中的黄曲霉毒素B1，证明该方法有良好的稳定性。1.3联用法联用法结合了多种方法一起用于检测黄曲霉毒素，相对于单一的方法，往往会显出其独特的优势。1.3.1免疫亲和柱-荧光光度法（IAC/SFB）免疫亲和柱-荧光光度法以单克隆免疫亲和柱分离技术为基础，在荧光光度法之前将样品提取溶液中的黄曲霉毒素用免疫亲和柱捕获，而后将其用甲醇洗脱，用荧光光度法测定其中黄曲霉毒素含量。由于免疫亲和柱是由与黄曲霉毒素B抗体偶联的免疫亲和球填充而成的，因此具有专一性。[14]且免疫亲和柱能大大减少样品中的杂质峰数量。[15]免疫亲和柱-荧光光度法检测时间短，结果准确性高，且较HPLC以及TLC而言使用的有毒有害有机溶剂少，对检测人员人体不会造成危害。但是其检测费用较高，目前暂时无法在我国普及。1．4其他方法目前，除了上述提到检测方法，还发展出了许多新的方法检测黄曲霉毒素。1.4.1表面增强拉曼散射技术表面增强拉曼散射技术被广泛应用于痕量物质检测[16]，高思敏[17]等人利用表面增强拉曼散射技术（SERS）进行了黄曲霉毒素含量的检测，该方法具有检测速度快、所需样品数量小的优点。1.4.2流式细胞数流式细胞术是一种快速定量分析技术，它能对单个粒子进行多参数分析。李咏宁等人建立了一种应用流式细胞术(FCM)检测黄曲霉毒素的方法[18]，该方法是建立在间接竞争免疫法的基础上产生的。由于流式细胞仪对每个微球的荧光信号是逐一收集和单个监测的，数据样本大，因此该检测方法的准确度较其他方法而言更高。1.4.3基于SMT的三维荧光导数光谱法检测三维荧光导数能够将获得的激发波长与发射波长或其他变量同时变化时候的荧光强度表示成激发波长—时间或者波长—发射波长等变量的函数。[19]杜树新等人还建立了通过支持张量机（SMT）的三维荧光导数光谱而检测食品中的黄曲霉毒素.[20]该方法通过将Savitzky-Golay多项式平滑微分方法扩展至三维荧光光谱，从而计算一阶导数光谱。并通过SMT方法建立校正模型实现定量分析。通过该方法对牛奶和白酒中的黄曲霉毒素检测证明，该方法建立的校正模型的性能要好于将张量转为向量再用SVM和PLS法建立的校正模型。2．主要几种分析检测方法的比较检测方法名称检测限值μg/Kg对人体是否存在危害性检测一个样品大致时间列入我国国家标准号高效液相色谱法（HPLC）1.0存在30分种GB/T18979-2003薄层色谱法（TLC）5.0存在大于4hGB/T5009.22-2003酶联免疫法（ELISA）0.01存在大于4hGB/T5009.22-2003免疫亲和柱-荧光光度法（IAC/SFB）1.0几乎没有15分钟GB/T18979-2003从图表中可以看出酶联免疫（ELISA）的检测限值最低，其次是高效液相色谱法HPLC以及免疫亲和柱-荧光光度法（IAC/SFB），而HPLC、TLC、ELISA均对人体有危害性，检测时长TLC=ELISA＞HPLC＞IAC/SFB。因此，通过比较，发现IAC/SFB检测时间短但检测限值较ELISA法高。ELISA较其他方法检测精度高但时间久。3．展望黄曲霉毒素的高毒性以及不易通过高温去除的特性对人类危害极大，随着人们对霉菌毒素认识水平的提生以及消费者对食品安全的关注度增加，黄曲霉毒素及其它霉菌毒素所引起的问题必将越来越受到重视。因此，发展建立快速有效的检测方法十分有必要。目前测定食品中黄曲霉毒素主要采用高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）、液相色谱－质谱法（LC--MS）、光谱法、酶联免疫法和液相色谱－飞行时间质谱法（LC－Q－TOF）等。我国标准采用的是高效液相色谱法（HPLC）和薄层色谱法（TLC）测定食品当中的黄曲霉毒素B１含量。传统的液相色谱法（HPLC）检测限值低且检测结果准确，但因为在检测过程中需要用到一些对人体有毒害的有机试剂，因此该方法会对检测人员的身体造成伤害。薄层色谱法（TLC）作为传统的检测方法，与液相色谱法一样会对工作人员造成伤害。因此，未来检测方法的发展趋势应该是使检测结果更加准确、检测过程更加安全。随着纳米技术的发展，表面增强拉曼散射（SERS）技术被广泛的应用于微量物质的检测。以表面增强拉曼散射技术为基础的检测黄曲霉毒素的方法，具有检测迅速、结果准确、需要样品数量少的优点，是未来黄曲霉毒素分析检测技术发展的趋势。此外，利用抗原抗体反应而设计的免疫传感器，具有