霍乱弧菌实验室检测.

霍乱弧菌的实验室检测目的:提高检出率,减少漏检以及误判的发生手段:检测人员是否有足够的责任心?检测试剂准备是否齐全且符合要求?是否严格按照检测流程进行操作?什么是霍乱?霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（V．cholerae）引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波及范围广、危害严重的甲类传染病。霍乱概述古典生物型小川型Ogawa(AB)O1群稻叶型Inaba(AC)埃尔托生物型彦岛型Hikojim(ABC)霍乱弧菌霍乱病原菌O139群（Bengal）非O1群O2-O200群腹泻病原菌病原体O1群，O139群霍乱弧菌发病特征：剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20－50％（重症病人达70－100％）培养特性：营养要求不高，兼性厌氧，37℃生长，怕酸嗜碱，pH:7.4-9.6快速生长检验依据：WS289-2008《霍乱诊断标准》霍乱防治手册（1999年第五版）霍乱的实验室检测样品的采集和运输不同样品的病原分离流程及技术要点粪便水体水产品，食品等平板分离及可疑菌落挑取菌落鉴定常用快速检测方法胶体金检测条荧光PCR检测检测工作中应关注的事项样品的采集和运输采集：病例：粪便、肛拭子、呕吐物未使用抗生素之前“健康”人：粪便、肛拭子其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品……监测：水样，水产品等运输：一般要求在3小时内室温（20-25℃）条件下送达实验室检测C-B运输培养基（pH8.4）;（或文腊二氏保存液）碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2）：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，尽量采用C-B运输培养基。粪便的采集与保存运送以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取1～3mL，成形便采取指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3～5cm处采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（ＰＨ8.６-9.2），同时划线分离选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板），如不能在６小时内送达实验室检测的样品，应插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基（或文腊二氏保存液）中送检。标本与保存液比例约为1∶5。分离培养要点（两管三板法）：挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第一板）。第一管碱性蛋白胨水在３７℃增菌６－８小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第二板），同时吸取0.1～0.2ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。第二管碱性蛋白胨水增菌１８小时后划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第三板）。粪便分离流程及技术要点水体的采集与保存运送水体的采集一般用无菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水(深度为30cm以内)500ml，密封加盖后于室温（20-25℃）3小时内送达实验室检测。分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）：取450ml水样，用1M氢氧化钠调整至pH8.4-9.2。然后加10倍浓缩碱性胨水50ml。再加入1%亚碲酸钾0.25～0.5ml和1000单位/ml青霉素1ml。37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）分离培养，同时吸0.1～0.2ml表层培养物转种于碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）。水体分离流程及技术要点水产品的采集与保存运送通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置涂抹采集：使用无菌棉签涂抹5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。整体或局部采集：在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物25克剪碎后，置灭菌均质杯或均质袋中，加入225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外壳等)整体放入100ml三角瓶中，加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。分离培养（两管两板法）：接种后的碱性蛋白胨水37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）．同时吸0.1～0.2ml表层培养物转种于10ml碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）。水产品分离流程及技术要点平板分离选择性分离平板应采用9cm分离平板（不建议采用7cm平板），一个平板分离一个样品（严禁一个平板分离2份或以上样品！！）。样品平板分离时应进行分区划线分离，平板分离的单个菌落数量应该达到50个以上。可疑菌落挑取经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验，鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良好后再次进行玻片凝集试验加以确证。庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。（TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）平板分离及可疑菌落挑取染色镜检革兰染色阴性的短杆菌血清凝集试验：分别使用O1群，O139群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行对照凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。生理盐水不凝集，O1群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型血清进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落为稻叶型，小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型血清和小川型血清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些小川型菌落自身会带有少量的C抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。生理盐水不凝集，O139群血清明显凝集的菌落，一般为O139群，但其与O22群及O155群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行进一步确认。菌落鉴定O1群和O139群抗原构造与血清分型型别群特异性抗原型特异性抗原AO139BC小川+++少量稻叶+—+彦岛+++O139—+——国内商品化的霍乱检测血清国外血清：日本生研，泰国S&A血清等进一步实验氧化酶试验1％盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液粘丝试验0.5％去氧胆酸钠水溶液生化鉴定生化鉴定管：发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、产酸不产气能分解色氨酸赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+）精氨酸双水解酶（-）霍乱弧菌生化鉴定管（11种生化,套装，环凯）；生化鉴定条：梅里埃API20E鉴定条等全自动生化检测仪检测：梅里埃VITEK2COMP全自动生化鉴定卡等进一步分型鉴定(省CDC进行)噬菌体分型PFGE脉冲场分型进一步实验针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌后的菌液进行快速检测胶体金快速检测卡O1群霍乱胶体金标记快诊卡O139群霍乱胶体金标记快诊卡荧光PCR快速检测试剂盒O1群、O139群双色荧光检测试剂盒霍乱CTX毒力基因荧光检测试剂盒注：快速检测并不能替代常规检测的进行，只是作为辅助检测的一种手段霍乱快速检测技术的应用霍乱弧菌胶体金免疫层析检测荧光PCR检测霍乱弧菌病例标本检测环境和食品调查的初筛方法O1群、O139群双色荧光检测试剂盒深圳生科源生物技术有限公司O1群和O139群霍乱弧菌的检验程序鉴定分型确诊报告胶体金、荧光PCR快速诊断增菌培养（碱胨水）分离培养庆大霉素、4号、TCBS琼脂标本（粪便等）玻片凝集阳性（结合菌落、菌体形态）凝集菌落或可疑菌落纯培养（营养琼脂或克氏双糖培养）第二次增菌（碱胨水）初步报告10-20小时6-8小时10-20小时直接检测工作中应关注的事项生物安全与个人防护（生物安全2级实验室操作，做好个人防护，整个培养流程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒）培养基的配备与质量控制（是否新鲜，含量、PH值、保存条件是否达标，分离平板、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求，是否在有效期内使用等）可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平板！！）做好样品的相关登记记录。