青霉素类抗生素的生物制药工艺研究

青霉素类抗生素的生物制药工艺研究专业班级生物工程学号101454218姓名汪芳俊摘要：抗生素指由细菌、霉菌或其它微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类物质。青霉素的使用使人类战胜了因为各类感染所带来的痛苦，由于抗生素的优良抗菌抗病毒做用，抗生素的使用一直被密切研究，新型抗生素的研发和使用更是意义重大，并且有不可估量的经济效益。通过对抗生素生产工艺的不断学习和研究，本文引以青霉素的生产工艺为例，从而对揭示各类抗生素的工业生产工艺，为抗生素的生产和研究提供指导。关键词：抗生素；青霉素；生产工艺；提炼；abstract:,thediscoveryanduseofantibioticstohumanhealtharehigherthaneverbefore,becauseallmankindovercomethepaincausedbyinfection,Sinceantibioticsdogoodantibacterialandantiviraluse,antibioticusehasbeencloselystudiedthedevelopmentanduseofnewantibioticsisofgreatsignificance,andhaveimmeasurableeconomicbenefits.Thetermantibioticproductionprocessthroughthecontinuousstudyandresearch,thepapercitedanexampletopenicillinproductionprocess,thusrevealingallkindsofantibioticsinindustrialproductionprocessesforantibioticproductionandresearchguidance.keywords:Antibiotics;penicillin;productionprocess;extraction;1前言抗生素是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。是指“在低浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称”。它的作用大致有五点：抗细菌感染、治疗肿瘤、抗病原虫、免疫抑制剂、刺激植物生长。现临床常用的抗生素有微生物培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。抗生素的生产目前主要由微生物发酵法进行生物合成，还可将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法进行分子结构改造而制成各种衍生物，称半合成抗生素。抗生素是次级代谢产物，这些产物与微生物的生长繁殖无明显的关系，物质的构造也因微生物种属不同而异，但产生这些物质的代谢过程基本相似。微生物生产抗生素的原理：控制发酵条件，使抗生素产生菌的代谢向合成抗生素的方向发展，从而有利于抗生素的产生。2青霉素2.1青霉素概述青霉素又被称为青霉素G、盘尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。但它不能耐受耐药菌株所产生的酶，易被其破坏，主要对革兰氏阳性菌有效。2.2青霉素的理化性质及应用2.2.1稳定性固体青霉素盐的稳定性与其含水量和纯度有很大的关系；2.2.2溶解度青霉素游离酸在水中溶解度很小，易溶于有机溶剂如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和乙醚中，而其钾盐、钠盐易溶于水和甲醇，可溶于乙醇2.2.3降解反应：青霉素是很不稳定的化合物，遇酸碱或加热易分解而失去活性，并发生分子重排。2.2.4紫外吸收2.2.5过敏反应2.3作用机制细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。生长中的细胞有效，静止细胞无效2.4天然存在的青霉素青霉素是一族抗生素的总称，它们是由不同的菌种或扎起不同的培养条件所得的同一类化学物质，其结构通式如图1.NSHHCH3CO2HCH3RCONHOH图1.青霉素的结构通式3发酵条件下的生长过程第1期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。第2期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。第3期：形成脂肪包涵体，机理贮藏物，没有空泡，嗜碱性很强。第4期：脂肪包涵体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。第6期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状。释放游离氨，pH上升。第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。镜检：规定时间取样，显微镜观察7个时期的形态变化，控制发酵。1－4期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。4－5期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。在第六期到来之前结束发酵。4青霉素的发酵工艺及过程4.1工艺流程冷冻管母瓶斜面孢子培养大米孢子孢子培养一级种子瓶种子培养25℃，40~45h1:2VVM二级种子罐种子培养25℃,13~15h，1:5VVM发酵罐发酵22~26℃,1：（1~0.8）VVM,6~7d放罐冷却至15℃提炼25℃，6~7天25℃，6~7天图2.青霉素的发酵工艺路线[7]4.2生物合成法生产青霉素的工艺过程4.2.1生产菌种1、菌种——产黄青霉菌2、方法——诱变育种得到高产的菌株生产菌种是抗生素生物合成的主要基础，它必须具备产量高、性能稳定和容易培养等特点。为了防止菌种衰退，生产菌种必须以休眠状态保存在砂土管或冷冻干燥管中，并置于0～4℃恒温冰箱，使用时可临时取出，接种后仍须冷藏。生产菌种一般都严格规定其使用期，一般砂土管为1～2年，生产菌种应不断纯化，淘汰变异菌落，防止衰退。4.2.2孢子制备这是发酵工序的开端，是一个重要环节。其方法将砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养，经传代活化。最适生长温度在25~26℃，培养6~8天，得单菌落，再传斜面，培养7天，得斜面孢子。移植到优质小米或大米固体培养基上，生长7天，25℃，制得小米孢子。每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。4.2.3种子制备及发酵罐培养工艺这一过程是使孢子发芽繁殖、以获得足够数量的菌丝，以便接种到发酵罐。种子培养要求产生大量健壮的菌丝体，因此，培养基应加入比较丰富的易利用的碳源和有机氮源。青霉素采用三级发酵：一级种子发酵：发芽罐.小罐，接入小米孢子后，孢子萌发，形成菌丝。培养基成分：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。空气流量1：3（体积比）；充分搅拌300－350r/min；40~50小时；pH自然，温度27±1℃。二级发酵罐：繁殖罐.大量繁殖。玉米浆、葡萄糖等。空气流量1：1－1.5；搅拌转速250－280r/min；pH自然，温度25±1℃；时间10－14h。三级发酵罐：生产罐。花生饼粉（高温），葡萄糖，尿素，硫酸铵,硫代硫酸钠,苯乙酰胺,CaCO3等。接种量为12~15%。青霉素的发酵对溶氧要求极高，通气量偏大，通气比控制0.7~1.8；150－200r/min；要求高功率搅拌，100m3的发酵罐搅拌功率在200~300Kw，罐压控制0.04~0.05MPa，于25~26℃下培养，发酵周期在200h左右。前60h，pH5.7~6.3，后6.3~6.6；前60h为26℃，以后24℃。抗生素生物合成较为复杂，影响因素比较多需要各方面的密切配合和严格操作，把住各个环节。发酵罐培养工艺图4.3青霉素的提炼工艺过程化学提取和精制的目的:从发酵液中制取高纯度的、合乎药典的抗生素成品。发酵液中常见的杂质有：菌丝、未用完的培养基、易污染杂菌、产生菌的代谢产物、预处理需要加入的杂质灯。4.3.1青霉素的提取遵循下面四个原则：⒈时间短，⒉温度低，⒊pH适中，⒋勤清洗消毒。4.3.2常用的提取方法有：溶媒萃取法、离子交换法、沉淀法。青霉素提纯工艺流程简图：4.3.1预处理发酵液结束后，目标产物存在于发酵液中，而且浓度较低，含有大量杂质，它们影响后续工艺的有效提取，因此必须对其进行的预处理，目的在于浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。是进行分离纯化的一个工序。4.3.2过滤发酵液在萃取之前需预处理，发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过滤或板框过滤，除掉菌丝体及部分蛋白。青霉素易降解，发酵液及滤液应冷至10℃以下，过滤收率一般90%左右。（1）菌丝体粗长10µm，采用鼓式真空过滤机过滤，滤渣形成紧密饼状，容易从滤布上刮下。滤液pH6.27-7.2，蛋白质含量0.05-0.2%。需要进一步除去蛋白质。（2）改善过滤和除去蛋白质的措施：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土为助滤剂。再通过板框式过滤机。滤液澄清透明，进行萃取。4.3.3萃取青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节pH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。4.3.4脱色萃取液中添加活性炭，除去色素、热源，过滤，除去活性炭。4.3.5结晶抗生素精制常有结晶法来制得高纯度成品。常有的几种结晶方法有：改变温度结晶:利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。利用等电点结晶:当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时，它在水溶液中溶解度最小，则沉淀析出。加成盐剂结晶:在抗生素溶液中加成盐剂使抗生素一盐的形式从溶液中能够沉淀结晶。4.4成品检验由于抗生素的生产一般采用生物合成法，虽经提取和精制，但其纯度仍不能达到百分之百，而且在生物合成过程中也会同时产生其它药效和药性不同的各种物质，在制品和加工、贮藏过程中也还可能引起抗生素的变质。因此，为了保证药品质量、用药安全，对抗生素各种成品都必须进行检验。抗生素产品常规检验项目一般包括：性状及鉴别试验、安全试验、降压试验、热原试验、无菌试验、酸碱度测定、效价测定、水分测定、混浊度测定、色泽颗粒细度测定等等。5结论抗生素作为20世纪的重大发现之一，它的发现和使用使人类健康得到空前提高，使人类战胜了因为各类感染所带来的痛苦，因而研究和使用抗生素具有重大的意义。本文通过对抗生素的介绍和研究，并对抗生素的经典药物青霉素生物制药工艺进行了总结，这必将使得我们更好的对抗生素类药物的生物制药工艺作出理论指导。本文不足之处还请各位提出意见和建议。参考文献[1]胡国勤.抗生素质控分析中HPLC分析方法的理论与实践.北京：气象出版社，2001[2]梁世中.生物制药理论与实践［M］，北京：高等教育出版社，2005.6（1）：290[3]吴晓英.生物制药工艺学[M]，北京：化学工业出版社，2009.3（1）：158-159[4]梁世中.生物制药理论与实践［M］，北京：高等教育出版社，2005.6（1）：300[5]盛贻林.微生物制药技术[M],北京：中国农民大学出版社，2008.8（1）：131[6]吴晓英.生物制药工艺学[M]，北京：化学工业出版社，2009.3（1）：160[7]熊宗贵.1999.生物技术制药.北京：高等教育出版社.[8]陈立军等.新型分离纯化技术—亲和超滤及其应用[J].膜科学与技术，2006.[9]张林生.生物制药技术.北京：科学出版社.[10]李刚等.2002.我国细胞工程制药的研究现状和发展前景.中国现在应用药学杂志.[11]董德祥.2002.疫苗技术基础与应用.北京：化学工业出版社.[12]郭勇.2000.生物制药技术.北京：中国轻工业出版社.[13]张致平.2004.抗生素与抗菌药发展史.首都医药.[14]侯云德.干扰素研究的意义,中华实验和临床病毒学杂志,2005年9月第19卷第3期.[15]刘运龙、程远国、刘学龙.干扰素研究进展动物医学进展,2008,29(2):85