非病毒基因载体PAMAM-HA聚合物体外细胞毒性的系列研究

非病毒基因载体PAMAM-HA聚合物体外细胞毒性的系列研究胡海梅1,李晓琳,梁双红（广东药学院,生命科学与生物制药学院，广东广州510006）【摘要】目的：研究非病毒基因载体聚酰胺胺型树状大分子-透明质酸（PAMAM-HA）的体外细胞毒性。方法：对已合成的多种PAMAM-HA聚合物，采用MTT法、流式细胞技术凋亡检测法，检测其对不同细胞的细胞毒性和诱导细胞凋亡的能力。结果：各聚合物的细胞毒性与聚合物溶液的浓度、聚酰胺胺型树状大分子（polyamidoamine,PAMAM）的代数及透明质酸（HA）的接枝量和接枝密度有关；聚合物中PAMAMG4-HA3850-5%、PAMAMG5-HA3850-5%可以诱导肝癌细胞Bel-7402细胞凋亡。结论：经不同接枝量和接枝密度的HA修饰的PAMAM，细胞毒性降低，聚合物PAMAMG4-HA3850-5%和PAMAMG5-HA3850-5%的细胞毒性略大，并且可以诱导肿瘤细胞凋亡。【关键词】PAMAM；HA；肿瘤细胞；细胞毒性；细胞凋亡Studyonbiologicalactivityofanon-viralgenevectorPAMAM-HApolymerHuHaimei,LiXiaolin,LiangShuanghong(SchoolofLifeScienceandBiopharmaceutics,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China))[Abstract]:Objective:StudyonthecytotoxicityofPAMAM-HAasanon-viralgenevectorinvivo.Methods:OurlaboratoryhadbeensynthesizedvariouspolymersPAMAM-HA.MTTassaywasusedtoevaluatethecytotoxicityofvariouspolymersondifferentcells.FlowcytometrytechniqueapoptosisassaywasusedtodeterminepolymerPAMAM-HAinducingapoptosisoncell.Results:Thecytotoxicityofeach基金项目：国家自然基金项目（31000429）1通讯作者：胡海梅（1975-），女，博士，副教授，主要从事缓、控释制剂、靶向药物载体、药物新材料和新剂型研究，电话：[phone]，Email：[e-mail]。polymerswasrelatedtotheconcentrationofthepolymer,themolecularweightofPAMAMandincubatingtime;PolymerPAMAMG4-HA3850-5%和PAMAMG5-HA3850-5%mayinduceapoptosisinBel-7402cell.Conclusion:PAMAMmodifiedbythegraftingdensityandquantityofthegraftofHAcanreducedthecytotoxicity;PolymerPAMAMG4-HA3850-5%andPAMAMG5-HA3850-5%hadhighercytotoxicityandmayinduceapoptosis.[Keywords]:PAMAM;HA;tumorcells;cytotoxicity;apoptosis非病毒载体主要有阳离子聚合物、阳离子多肽和阳离子脂质体等[1-4]，具有靶向性，低细胞毒性，较高的安全性，并且易于进行结构修饰等优点，已成为基因治疗中的热点[5,6]。聚酰胺-胺型树状大分子（PAMAM）由Tomalia等[7]人首次成功合成后，关于PAMAM的研究才逐步展开。PAMAM表面带正电荷的氨基基团可与带负电的DNA相互作用形成复合物，可以保护DNA免受核酸酶降解[8-10]，作为药物载体和基因载体具有较高的稳定性、生物兼容性良好、无免疫源性、使用剂量下低细胞毒性的优势[11-13]。但是，PAMAM的表面具有大量的带正电荷的氨基，易与带负电荷的细胞膜静电相互作用致使细胞凋亡[14-16]，具有一定的细胞毒性，并且会随着其代数的增加使细胞毒性增加，因此对PAMAM末端基团进行表面修饰，减少表面正电荷数目，以降低其细胞毒性[17,18]。透明质酸（Hyaluronic,简称HA），具有生物兼容性良好、非免疫原性、高生物活性及易被体内酶作用而天然降解、靶向性[19]等优势。因此本研究选择HA修饰PAMAM载体，以减少PAMAM的细胞毒性，增强生物相容性，提高PAMAM的靶向性。已合成含有不同接枝量（HA3850、HA17200）和接枝密度（5%、15%、25%）的多种聚合物PAMAM-HA，本文通过MTT法测定不同浓度的多种聚合物在不同细胞的细胞毒性以及AnnexinV-FITC/PI双染法考察多种聚合物诱导细胞凋亡的能力，同时综合评价了不同HA修饰PAMAM得到的多种PAMAM-HA聚合物的体外细胞毒性。1材料与方法1.1试剂PAMAM-HA（本实验室合成）；胎牛血清（Hyclone公司）；RPMI1640培养基（Gibco公司）；四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO，天津市百世化工有限公司)；流式细胞凋亡试剂盒（碧云天生物技术研究所）；胰酶（Invitrogen，USA）；增强型绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1（本实验室保存）。1.2细胞系人宫颈癌细胞系HeLa细胞，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，37℃，5%CO2的培养箱中生长，24-48h传代；人肝癌细胞系Bel-7402细胞，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，37℃，5%CO2的培养箱中生长，2-3d传代；人肝癌细胞系HepG2细胞，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，37℃，5%CO2的培养箱中生长，2-3d传代。1.3聚合物在不同细胞系中细胞毒性将Hela细胞、Bel-7402细胞、HepG2细胞接种于96孔板中，调整细胞密度为7500个/ml，20-24h后实验以不同浓度的各PAMAM-HA聚合物溶液100µl替换旧的完全培养液，各样品各浓度复孔4个，阴性对照组用新鲜无血清1640培养液替换，各PAMAM-HA聚合物母液（800μg/ml）用无血清RPMI1640培养液调整至下列质量浓度梯度为:50、100、200、300、500、800μg/ml。37℃，5%CO2的培养箱培养4h后，以含10%胎牛血清的培养液替换各孔溶液继续培养。40-48h后孔加入5mg/ml的MTT20µl，继续培养4h，小心吸尽上液，每孔加入DMSO溶液150µl，振摇15min使结晶充分溶解，用Bio-Rad酶标仪测定490nm处吸光度值(A)，取4孔平均。计算细胞活力=实验组A490/阴性对照组A490×100%。1.4聚合物不同作用时间的细胞毒性将Hela细胞接种于96孔板中，调整细胞密度为10000个/孔，20-24h后实验以不同浓度的各PAMAM-HA聚合物溶液100µl替换旧的完全培养液，各样品各浓度复孔4个，阴性对照组用新鲜无血清1640培养液替换，各PAMAM-HA聚合物母液（800μg/mL）用无血清RPMI1640培养液调整至下列质量浓度梯度为:50、100、200、300、400、500μg/ml。37℃，5%CO2的培养箱中，分别培养24h、48h、72h后，每空孔加入5mg/ml的MTT20µl，继续培养4h，小心吸尽上液，每孔加入DMSO溶液150µl，振摇15min使结晶充分溶解，用Bio-Rad酶标仪测定490nm处吸光度值(A)，取4孔平均。计算细胞活力=实验组A490/阴性对照组A490×100%。1.5聚合物/DNA复合物的细胞毒性将Hela细胞接种于96孔板中，调整细胞密度为10000个/孔，20-24h后，以w/w为25:1、30:1、35:1、40:1的各PAMAM-HA/DNA复合物溶液、w/w为3:1、5:1、8:1、10:1的PAMAMG4/DNA和PAMAMG5/DNA复合物溶液各100µl替换旧的完全培养液，各样品各w/w复孔4个，阴性对照组用新鲜无血清1640培养液替换。37℃，5%CO2的培养箱培养4h后，以含10%胎牛血清培养液替换各孔溶液继续培养。40-48h后孔加入5mg/ml的MTT20µl，继续培养4h，小心吸尽上液，用PBS清洗2遍，每孔加入DMSO溶液150µl，振摇15min使结晶充分溶解，用Bio-Rad酶标仪测定490nm处吸光度值(A),取4孔平均。计算细胞活力=实验组A490/阴性对照组A490×100%。不同w/w/的各聚合物/DNA复合物溶液配制：将各聚合物母液（200μg/ml）以无血清的1640培养基稀释至40μg/ml，DNA母液同样以无血清的1640培养基稀释至40μg/ml，按照不同重量比混合，涡旋15s，静置静止30min。1.6细胞凋亡率的检测将Bel-7402细胞接种于6孔板中，调整细胞密度为40×105个/孔，每孔2mL含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液。各聚合物母液（1000μg/ml）以完全培养液稀释至实验浓度，20-24h后弃去旧的培养液，以不同聚合物溶液2mL替换，阴性组以2mL完全培养液替换。24h后收集细胞，1000g离心5分钟，弃上清，用PBS洗两遍。1000g离心5分钟，弃上清，加入195µlAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5µlAnnexinV-FITC，轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育10分钟。1000g离心5分钟，弃上清，加入190µlAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10µl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测，AnnexinV-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。2结果2.1聚合物在不同细胞系中细胞毒性如图2.1和图2.2，聚合物PAMAMG4-HA3850-5%和聚合物PAMAMG5-HA3850-5%没有明显的细胞类型依赖性，两种聚合物的细胞毒性均随着浓度的增加而增加，溶液浓度达到100μg/ml以上后，细胞存活率低于80%；聚合物PAMAMG5-HA3850-5%的细胞毒性要高于聚合物PAMAMG4-HA3850-5%。图2.3和图2.4，各聚合物的细胞毒性均随着浓度的增加而增加，而聚合物PAMAMG4-HA3850-5%和聚合物PAMAMG5-HA3850-5%的细胞毒性要在浓度达100μg/ml以后远高于其他聚合物。聚合物PAMAMG4-HA3850-15%、PAMAMG5-HA3850-15%、PAMAMG4-HA3850-25%、PAMAMG5-HA3850-25%、PAMAMG4-HA17200-5%、PAMAMG5-HA17200-5%的细胞毒性接近，差异不明显。图2.1不同浓度聚合物PAMAMG4-HA3850-5%在不同细胞类型中的细胞毒性Fig.2.1CellviabilitiesofPAMAMG4-HA3850-5%polymeratvariousconcentrationsindifferentcells图2.2不同浓度的聚合物PAMAMG5-HA3850-5%在不同细胞类型中的细胞毒性Fig.2.2CellviabilitiesofPAMAMG5-HA3850-5%polymeratvariousconcentrationsindifferentcells图2.3聚合物PAMAMG4-HA3850-5%、PAMAMG4-HA3850-15%、PAMAMG4-HA3850-25%、PAMAMG4-HA17200-5%在Hela细胞中的细胞毒性Fig.2.3CellviabilitiesofPAMAMG4-HA3850