重组门冬酰胺酶Ⅱ的制备

重组门冬酰胺酶Ⅱ的制备摘要：L-天冬酰胺酶具有显著的抗肿瘤作用，尤其是广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗。采用渗透振扰破壁法、硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、DEAE-纤维素层析等步骤提取和纯化重组L-门冬酰胺酶Ⅱ。关键字：L-门冬酰胺酶Ⅱ;制备；分离;纯化；稳定剂1.L-天冬酰胺酶治疗ALL的作用机制L-天冬酰胺酶(E.C，3.5.1.1)是酰胺基水解酶，是1个广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的酶类药物。L-天冬酰胺酶在机体内可催化天冬酰胺的水解，生成天冬氨酸和氨，在大量的ALL病人中，其肿瘤细胞依赖外源性的L-天冬酰胺才能生存，而正常细胞自身能合成L-天冬酰胺。L-天冬酰胺酶抗白血病的作用机制是它能够快速消耗血循环中的L-天冬酰胺，从而消耗肿瘤细胞合成蛋白质所必需的底物，快速抑制蛋白质合成，而不影响正常细胞，此即L天冬酰胺酶的选择性细胞毒作用。[1]2.L-天冬酰胺酶的分离纯化工艺2.1酶的几种提取方法L-天冬酰胺酶最初是从豚鼠的血清中提取的，含量很低，后来开发发酵法生产，采用大肠杆菌;欧文菌以及粘质赛氏杆菌(serraliamarcescem)等产生菌制备。大肠杆菌产生的L-天冬酰胺酶包括天冬酰胺酶I和天冬酰胺酶Ⅱ，其中天冬酰胺酶I没有抗癌活性，存在于细胞质中，而有抗癌活性的天冬酰胺酶Ⅱ则分泌到细胞周质中。大肠杆菌来源的天冬酰胺酶的提取方法常用有冷丙酮干燥破壁、蔗糖溶液提取法和反复冻融法、超声破壁法等.2.1.1蔗糖溶液提取法向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液(蔗糖40%，溶菌酶200mg/L，EoTA10mmol/L，pH7·5)，在30C振荡2小时，8000r/min离心30分钟，收集上清酶液。2.1.2冷丙酮干燥破壁法将菌体悬液倒入10倍量预先冷却的丙酮中，搅拌15分钟，5000r/min离心20分钟收集沉淀，于室温风干、研碎。向菌体干粉中加入10倍体积0.0lmol/L，pH8.0硼酸缓冲液.于室温下搅拌30分钟，加入氯化锰溶液沉淀核酸，离心收集上清酶液。2.1.3反复冻融法将菌体在-30C和室温两种温度反复冻融9次，用30mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5)浸提30分钟，8000r/min离心回收上清酶液。1.5.4超声破壁法l克湿菌体悬浮在40毫升10mmol/L、pH7.5磷酸缓冲液中，超声处理(输出300W，超声10秒，间隔30秒)20分钟。处理过程中用冰浴降温。用氯化锰沉淀核酸，400or/min离心20分钟回收上清酶液。由刘景晶等[2]实验验证蔗糖溶液提取法的提取收率最高。2.2酶的纯化为了保护酶的活性在固相分离沉淀时采用较为温和的硫酸铵分级沉淀具体方法为用蔗糖溶液提取法获得的酶液，加入硫酸按至55%饱和度，调pH至7.0，室温搅拌1小时，离心除去沉淀。上清液中加入硫酸按到90%饱和度，离心收集沉淀。实验验证破壁液中酶浓度高于378IU/ml时,酶易与杂质-起沉淀,回收率下降,但过低时,虽然回收率增高,但杂质的去除率必定会下降,故应选择378IU/ml左右进行沉淀。在pH为4.9时,盐析的沉淀效果最好,回收率达89.1%。沉淀物用50mmol/L、pH7.0磷酸缓冲液溶解并透析。透析后的酶液通过预先用10mmof/L、pH7·6的磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素DE52层析柱(r.0又30em)。用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱，流速为40ml/h。收集显示天门冬酰胺酶活性的组分。将洗脱液调pH4.8，通过预先用50mmol/L、pH4.9磷酸缓冲液平衡的cM-纤维素eM52层析柱(1.0X8.oem)，用50mmof/L、pH5.2磷酸缓冲液洗脱，收集显示天门冬酰胺酶活力的组分，冻干后得天门冬酰胺酶冻干粉。由蔡丽萍等[3]研究发现在DEAE-Sepharose层析柱纯化之后增加-个亲和层析。亲和层析柱对L-天门冬酰胺酶的专-吸附性大大提高了分离纯化的分辨率。2.3冻干状态下酶保护剂的选择王宏等[4]实验证明,在溶液状态下酶与甘露醇之比为1∶2(W∶W)时,在冻干状态下酶与甘露醇之比为1∶1(W∶W)时,保护作用最佳。与无稳定剂酶组相比,溶液状态及冻干状态的t25℃0.9分别增加16.5倍和7倍..3蛋白质浓度测定按Lowy法用Folin酚试剂测定。4高效毛细管电泳WatersQuanta4000E石英毛细管,l=37.5cm。流动相80mmol/LPO3-4,pH7;电压12kV,电流68μA,进样方式及时间H/10s,检测波长214nm。参考文献[1]吴晓英，吴振强，林影，夏枫耿.L-天冬酞胺酶的研究进展[J]广东药学2003年第13卷第6期[2]刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐.大肠杆菌L-天门冬酸胺酶的提取和纯化[J]药物生物技术1995，2(l)[3]蔡丽萍,杨冠东,卢勇涛,杜少平.L-天门冬酰胺酶的提取和纯化工艺改进[J]广东药学2002年12卷第5期[4]王弘,吴梧桐,刘景晶,顾学裘重组L-天冬酰胺酶制剂稳定性研究[J]药物生物技术1997,4(2)