食品微生物检测期末论文

1基因芯片技术在微生物检测中的应用摘要:基因芯片技术作为一种前沿生物技术，具有高通量、快速、灵敏的优点，在生物学和医学各领域都有广泛的应用。本文主要对其原理、应用领域和在微生物检测中的应用做了一些介绍，分析了基因芯片技术发展中存在的一些问题，并对前景做了展望。关键词:基因芯片；微生物；检测；应用；发展前景21世纪，随着人类基因组计划(HumanGenomicProgect,HGP)的完成，后基因组时代揭开了序幕，人类正从结构基因组学(Structuralgenomics)进入功能基因组学(Functionalgenomies)和功能蛋白组学(Functionalproteomics)时代。自从1992年Afymetfix公司首次合成第1块基因芯片以来，在之后的十几年里该技术以其具有高通量、平行性、微型化、自动化、快速灵敏、样品用量少等显著特点被广泛应用。基因芯片技术(genechiptechnology，GCT)作为21世纪生物技术的重要发展，在许多领域均显示出了巨大的利用价值[1]。1基因芯片概念和原理基因芯片也称DNA微阵列，是生物芯片的一种[2]。基因芯片原理最初是由核酸的分子杂交衍生而来的，即应用已知序列的核酸探针对未知序列的核酸序列进行杂交检测。基因芯片制备及检测流程是利用原位合成法或将已合成好的一系列寡核苷酸以预先设定的排列方式固定在固相支持介质表面，形成高密度的寡核苷酸的阵列，样品与探针杂交后，由特殊的装置检出信号，并由计算机进行分析得到结果[3]。该技术可检测各种环境或媒介中的微生物，研究复杂微生物群体的基因表达。与传统方法相比，GCT先进性主要体现在：(a)GCT可以对环境中的微生物实现高通量和并行检测，一次实验即可得出全部结果；（b）操作简便快速，整个检测4h基本可以出结果，而传统方法一般需4～7d时间；（c）特异性强，敏感性高[4]。1.基因芯片的制备：主要包括载片处理、基因片段点阵和固定化等步骤，其中点阵和固定化技术主要有原位合成和合成后交联2种。2.样品的制备:样品经处理提取到纯度足够高的DNA后，进行PCR扩增以富集目标分子并对目的基因进行标记，或将目标基因转录后制备成基因文库。23.分子杂交:标记后的样品双链DNA一般先要经过高温变性为单链DNA再与芯片上的单链寡核苷酸探针杂交。4.杂交信号的检测:样品与探针杂交反应结束并经洗涤后，完全杂交发生强的荧光信号或特殊波长的信号，不完全杂交则信号较弱，若不能杂交仅能测到芯片原有的荧光信号或检测不到荧光信号。通过计算机控制的高分辨荧光扫描仪可并行采集大量的杂交信号，利用软件数据处理后可进行靶基因的综合信息分析[5]。2基因芯片技术的应用领域基因芯片技术具有微型化、集约化和标准化的特点，在分子生物学研究、医学临床检验、生物制药和环境医学领域得到了广泛的应用。2.1科研领域GCT能够快速、准确地分析数以千计基因组信息，在科研各个领域具有广泛的应用前景，主要表现在基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。传统的实验方法研究细胞中的上千个基因的改变必须首先提取细胞中足量的核酸，然后标记每一种探针，再分别进行分子杂交检测。而采用GCT检测基因表达的改变能够节省大量的人力、物力和财力。2.2生物制药领域各大药厂和生物技术公司已经开始使用GCT进行新药的研发和筛选。应用GCT进行基因测序、基因表达检测和新的遗传标志如单核苷酸多态性定位等，对寻找新的功能基因、寻找新的药物作用靶点和开发新的基因药物具有重要意义。采用GCT可以检测不同物种、不同组织、不同病种、不同处理条件下的基因表达改变，从而指导开发具有不同用途的诊断试剂盒。2.3医学诊断2.3.1在优生方面目前知道有600多种遗传疾病与基因有关。妇女在妊娠早期用DNA芯片做基因诊断,可以避免许多遗传疾病的发生。2.3.2基因芯片在医学领域的应用基因表达及调控研究人类的某些疾病及其后遗症相关基因可因内外环境异常而出现异常表达,因此可利用GCT对这些异常表达基因进行检测,找到其与疾3病的相互关系,研究疾病发生的基因调控机制,可从根本上预防和治疗疾病。其次,人类成长的不同阶段,基因表达也有很大差异,利用GCT可找出这些差异表达基因,研究不同时段及情况下的基因调控机制。最后,在一些多基因与环境因素共同作用的疾病筛查中,如糖尿病、冠心病、高血压等，GCT作为较理想的了解基因相互作用关系的技术之一,也将扮演重要角色。2.3.3应用于器官移植、组织移植、细胞移植方面的基因配型：如HLA分型。2.3.4基因芯片可应用于病原体诊断：如细菌和病毒鉴定、耐药基因的鉴定等。2.3.5在环境对人体的影响方面已知花粉过敏等人体对环境的反应都与基因有关。若对与环境污染相关的200多个基因进行全面监测，将对生态环境控制及人类健康有重要意义。2.3.6法医学方面DNA芯片比早先的DNA指纹鉴定更进一步，它不仅可做基因鉴定，而且可以通过DNA中包含的生命信息描绘生命体的脸型长相外貌特征。这种检验常用于灾难事故后鉴定尸体身份以及鉴定父母和子女之间的血缘关系[6]。3基因芯片技术在微生物检测中的应用3.1在食源性致病微生物检测中的应用细菌、病毒和真菌等微生物是引起食品安全问题的重要危害因素，严重威胁人类的健康。目前传统食源性微生物的检测方法主要包括前增菌培养、分离、生化鉴定和血清型鉴定等程序，但过程繁琐，而且操作相对独立，很难及时、高通量的对食品进行检测。GCT可以对食品中的致病菌实行高通量和并行检测，一次实验即可得出全部的检测结果，且操作简单快捷、特异性强并且敏感性高，整个检测在几个小时内即可得到检测结果。预计基因芯片检测食源性致病微生物技术将广泛应用于出人境检验检疫、食品质量控制、突发食品安全事件检测，将为食品安全提供更有力的技术保障。3.2在传染性致病微生物检测中的应用SARS冠状病毒在2003年曾在世界范围内流行，当时由其引起的严重急性呼吸综合征病死率高，虽然现在具有多种血清学和分子生物学技术用于病原体检测，如：ELISA、IFA等，但是没有任何方法能够在感染早期确认好排除SARS—CoV的感染。清华大学联合中国军事医学科学研究所研制的70—mer基因芯片对4SARS—CoV进行早期检测，他们试验证实了基于基因芯片的分子生物学检测方法对于SARS—CoV的检测是具有高度特异性而且可用于早期的检测。他们的结果证实基于基因芯片的分子检测技术对SARS—CoV的检测是具有特异性的，而且对SARS病人的血清的检测率比单独PCR检测高8%。3.3在环境微生物群落分析中的应用微生物的生态多样性在各种生态系统的功能和持续都起着综合的、独特的作用，因而关系到地球在物质平衡、大气构成、地质形成等方面的变化，如微生物所进行的反硝化作用使土壤、海洋的氮预算失去平衡，所形成的中间产物NO和N：O的积累则是全球气候变暖和臭氧层的破坏的主要原因之一。另外，微生物在环境的生物治理中有着极为重要的作用。所以弄清楚微生物群落的组成、结构和功能，它们对毒素污染、气候变化、农业和工业活动等环境变化的反应和适应，对于持续和恢复理想的尘态功能是非常必要的。然而，仅有小于1%的微生物能人为培养，微生物群落的定性和对其在自然环境中的种群的检测是长期困扰着微生物学家和生态学家的一大难题。现已表明GCT是研究环境微生物群落的一种强有力的研究工具，同时也是研究原核和真核生物基因多态性的极好方法。与传统的以膜为基础的杂交方法比较，以载玻片为支撑物的GCT具有高密度、快速检测、基于多荧光素标记的平行检测等多种优势，并且还有相对成本低、自动化、低背景噪音等特点。可以预计，GCT将是研究微生物群落的一种潜在有力的方法。3.4在微生物菌种鉴定中的应用利用基因芯片杂交图像进行细菌基因分型与菌种鉴定，筛选监测细菌抗药性基因。应用分枝杆菌基因芯片进行基因分型与菌种鉴定，筛选监测结核分枝杆菌利福平抗药性基因突变。Gingeras等利用rpob寡核苷酸芯片技术与常规双脱氧核苷酸测序方法分析了10种分枝杆菌种间与种内的序列多样性，并确证了几种特异性单碱基多态性。利用基因芯片技术可以对细菌基因组多个基因表达同时进行定量分析，为了解细菌调节网络，研究细菌对环境信号或药物的反应，研究细菌侵，袭力的发生提供了一种直接、高效的检测方法[7]。4问题与前景GCT是20世纪90年代早期发展起来的一项革命性的新技术，它具有并行性、微型化和自动化的特点。但它还没有大量的转化为商品使用，因为仍存在一些技5术问题，主要有：第一，由于样品的制备仍与传统的样品制备一样，依赖于各种生物、物理和化学手段实现，阻碍GCT向微型化、集成化、自动化发展的环节就是样品制备的滞后，样品制备是制约GCT发展的“瓶颈”[8]。第二，GCT所需的寡核苷酸合成仪、点样仪和扫描仪等仪器价格昂贵，导致成本过高。目前芯片检测的重复性不是很稳定，有一定程度的假阳性，这与影响杂交的各种因素有关，必须充分研究了各种因素对杂交的动力学的影响，才能提高芯片的特异性。第三，由于不同的实验室、不同的实验人员对芯片检测的结果判断没有统一的标准，造成了芯片检测在国际上没有标准化。第四，还需丰富微生物的基因组库，进一步提高信号检测的灵敏度。GCT是一项综合的技术，它可以融入各种新的技术。不对称PCR制备样品的文章已有不少，但不对称PCR用于制备单链探针的报道还几乎没有。近年来发展的液相芯片（liquidchip）又称悬浮芯片（suspensionarray）,由于杂交反应在悬浮的液相中进行，因此需要反应时间很短，杂交后经常不需要清洗就能直接读数，所以检测效率比固相杂交更高。GCT发展的最终目标是将各种生物化学分析操作的整个过程，从样品制备、生化反应到结果检测，都集成化并微缩到芯片上完成，即构建微缩芯片实验室（lab-on-chip）。随着技术的不断发展和研究的更加深入，GCT必将对21世纪的社会经济和发展、人类的生活和健康产生更加深远的影响[9]。参考文献：[1]武瑞，连学昭.基因芯片技术在中药研究中的应用[J].中兽医医药杂志，2005，24（1）：21-23[2]JosePhW.FromDNAbiosensorstogenechips.NucleicAcidsRes.2000，28：3011-3016[3]GahigMWegrzynGAnintroductiontoDNAchips:Principles，technology,applicationsandalysisActaBiochimPol，2001,48：615-622.[4]郑大明，张静.基因芯片技术在微生物检测和研究中的应用[J],食品科学杂志，62005,2(8)：188-190[5]胡娜,许杨.基因芯片技术及其在微生物检测中的应用[J],中华预防医学杂志，2005,39(2)：141-142[6]百度文库.基因芯片技术的应用现状和展望[7]杨全凤.基因芯片技术在微生物检测中的研究应用[J],中国医药指南，2012,10（2）：67-68[8]邢婉丽,程京.生物芯片技术[M],清华大学出版社，2004.[9]陈圣均，孔繁德，徐淑菲，彭小莉，黄标敏.基因芯片技术在微生物检测中的应用研究进展[J],中国畜牧兽医文摘，2013,29(5)：40-41,37