食品微生物检验学实验指导2013-03-08

1食品微生物检验学实验指导2013-3-192实验1菌落总数测定主要内容：1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种与琼脂倾注；3）24h后菌落计数及结果报告。实验2大肠菌群MPN测定主要内容：1）样品的称取、匀浆和稀释；2）接种于乳糖胆盐发酵管，培养；3）24h后观察产酸产气情况，划线于EMB琼脂，培养；3）48h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；4）查MPN检索表，报告结果。实验3大肠杆菌检验主要内容：1）样品前处理；2）增菌（肠道增菌液）；3）分离（麦康凯或伊红美蓝琼脂）；4）革兰氏染色、镜检；5）生化试验（TSI，pH7.2尿素，甲基红试验和吲哚试验，V-P试验和枸橼酸盐试验）实验4金黄色葡萄球菌检验主要内容：1）将金黄色葡萄球菌和链球菌肉汤培养物划线于普通琼脂、血液琼脂，接种生化培养基，进行纸片法药敏试验，培养；2）24h时观察菌落特征，革兰氏染色、镜检；3）观察主要生化试验结果和药敏试验结果。4）报告。实验5魏氏梭菌检验主要内容：1）细菌筛选（亚硫酸盐－多粘菌素－磺胺嘧啶，SPS琼脂）；2细菌培养（液体硫乙醇酸盐培养基，FT培养基）；3）动力硝酸盐还原实验；4）暴烈发酵实验；5）卵黄脂酶水解实验。实验6罐头食品检验主要内容：1）罐头感观检查；2）pH值测定；3）染色镜检；4）接种培养（庖肉培养，溴甲酚紫葡萄糖肉糖，麦芽浸膏汤）5）平板筛选（锰盐营养琼脂平板，血琼脂平板，卵黄琼脂平板）实验7PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌主要内容：1)以鼠伤寒沙门氏菌以SdiA为模板设计引物：(PCR产物长度：562bpFsdiA:5′-TGGCAGCAGAGGATGTTTAT-3′RsdiA5′-TCGATCTCCGATGAGGTCTT-3′2)细菌单克隆水悬浮后做模板，做PCR3)电泳检测是否扩出条带。实验8霉菌检验主要内容：1）样品稀释2）平板接种培养（马铃薯－葡萄糖琼脂，孟加拉红琼脂）；3）菌落计数3实习周:鸡蛋中沙门氏菌筛选、分离、生化鉴定及嗜菌体检测主要内容：（一）样品前处理及增菌培养；（二）沙门氏菌在选择平板上菌落特征观察；（三）沙门氏菌染色特性和生化特性观察；（四）沙门氏菌噬菌体鉴定。4实验一菌落总数测定[目的与要求]1.通过本试验要求掌握食品的菌落总数测定的方法，菌落计数和报告方式，以及经常食用的各类动物性食品的菌落总数标准。2.菌落总数是指食品检样经过适当处理，在一定的条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数，其也是判定食品被污染程度的标志。[实验器材及试剂]温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、稀释液、营养琼脂、牛奶等。[实验内容]（一）检样稀释及培养：1.以无菌操作，将检样（牛奶）0.5ml放于含有4.5mL灭菌生理盐水试管内，经充分振摇或研磨作成1：10的均匀稀释液。2.用无菌移液器吸取1：10稀释液0.5ml，注入含有4.5mL灭菌生理盐水的试管中振摇试管混合均匀，作成1：100倍稀释。3.更换枪头后，再用无菌移液器，按（2）操作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次换一只1mL无菌枪头。4.根据卫生标准要求或对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，用移液器吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作2个平皿。5.稀释液移入平皿后，应立即将冷至46℃左右营养琼脂培养基（可放置46℃水浴中保温）注入平皿约15-20ml，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有lml灭菌稀释液的灭菌平皿内，作空白对照。6.待琼脂凝固后，翻转平板，置37℃温箱内培养48±2h。（二）菌落计数1选取30-300CFU之间，无蔓延生长的、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。5（三）结果与报告1菌落总数的计算方法1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：N=∑C/(n1+0.1n2)d（1）式中：N——样品中菌落数；ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）。示例：稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度菌落数（CFU）232，24433，35N=∑C/(n1+0.1n2)d=(232+244+33+35)/[2+(0.1×2)]×10-2=544/0.022=24727上述数据按2.2数字修约后，表示为25000或2.5×104。1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。62菌落总数的报告2.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。[思考题]1菌落总数的食品卫生学意义？2影响本实验结果的因素有哪些？7实验二大肠菌群数的测定[目的与要求]1．掌握大肠菌群MPN的测定原理与方法，及实验结果报告方式。2．了解大肠菌群的食品卫生学意义[原理]大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（themostprobablenumber-简称MPN）表示。[实验器材及试剂]样品：牛乳温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水等。[实验内容]一、常规检验法1检样稀释及培养取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同,做成10倍递减的均匀系列稀释液，从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。2初发酵实验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。3复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。84大肠菌群最可能数（MPN）的报告按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。[思考题]1为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？2复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需加胆盐？表3-2大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN100ml（g）95％可信限1ml（g）×30.1ml（g）×30.01ml（g）×3下限上限000000000123＜30306090＜590000011110123306090120＜51300000222201236090120160＜5200000033330123901301601901021011110000012340701101501023011111111012370110150190303601111222201231101502002403036011133301216020024030360913329022220000012390140200260103702222111101231502002703403044022222222012321028035042070703904702222333301232903604405301001500333300000123230390640950407015012001300180033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000≥240003607101500130002400048000注：①表采用3个稀释度[1mL（g）、0.1mL（g）和0.01mL（g）]，每稀释度3管。②内所列检样量如改用10mL（g）、1mL（g）和0.1mL（g）时，表内数字相应降低10倍；如改用0.1mL（g）、0.01mL（g）和0.001mL（g）时，则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。10实验三食品中致病性大肠杆菌检验[目的与要求]（1）了解病原性大肠埃希氏菌的种类与非病原性大肠埃希氏菌的区别。（2）掌握病原性大肠埃希氏菌检验的原理和方法[原理]正常情况下，大肠埃希氏菌不致病，而且还能合成微生素B和微生素K，生产大肠菌素，对机体有利。但当机体抵抗力下降或大肠埃希氏菌侵入肠外组织或器官时，可作为条件性致病菌而引起肠道外感染。有些血清型可引起肠道感染，已知的引起致病性大肠埃希氏菌有4类，即产肠毒素大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌和肠道致病性大肠埃希氏菌。[实验器材及试剂]样品：猪肉温箱、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、肠道菌增菌肉汤、营养肉汤、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂（EMB）、三糖铁琼脂（TSI）、尿素琼脂（pH7.2）、蛋白胨水、靛基质试剂、甲基红、枸橼酸盐、赖氨酸脱羧酶试验培养基等。[实验内容]1增菌以无菌操作称取10g样品，在无菌研钵内，用无菌剪刀剪碎样品并加入10ml生理盐水和适量灭菌沙，将样品磨碎。然后将其加入90ml营养肉汤内，于36±1℃培养6h。挑取1环，接种于5ml肠道菌增菌汤内，于42℃培养18h。2分离将肠道增菌液分别划线接种于麦康凯和伊红美蓝琼脂平板上，于36±1℃培养18-24h，观察菌落。3生化试验平板上挑菌直接接种于三糖铁（TSI）、蛋白胨水、尿素琼脂（pH7.2）、赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36±1℃培养18-24h。同时，对细菌培养物做甲基红试验、靛基质试验和枸橼酸盐利用试验。TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，靛基质和甲基红试验阳性，V-P试验和枸橼酸盐利用试验阴型为大肠埃希氏菌。114染色镜检对培养菌通过革兰氏染色镜检。5血清学检验[结果和实验结论]（1）记录实验结果，书写实验报告。（2）总