食物中蛋白质含量的测定

一、实验摘要：蛋白质是含一定量氮的有机化合物。其测定方法也有很多种。不同的方法都有其优点和缺点，以及它们的适用范围不同。紫外吸收法（方便快捷，0.2-2mg/ml）凯氏定氮法（粗蛋白测定，0.2–2.0mg/ml)双缩脲法（1-10mg/ml)福林酚法（0.005-0.10mg/ml)G250（0.025-0.20mg/ml)（考马氏亮蓝法）BCA法（0.010-1.2mg/ml；0.0005-0.001mg/ml）此次实验采用牛奶样品在凯氏烧瓶中经浓硫酸和催化剂消化后，使蛋白质分解，产成的氨与硫酸结合生成硫酸铵，再在强碱条件下蒸馏出氨，并用硼酸吸收，以标准盐酸滴定，根据标准酸消耗的量，乘以一定系数，即可计算样品中蛋白质的含量。此次实验中使用的是乳制品，系数F=6.38.这种测定方法即为凯氏定氮法。因为食品中除蛋白质外，还含有其他含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白质。此次实验后，我们组的最终得率为2.77%。二、实验目的：1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理，蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等3、侧面了解测定食品中蛋白质含量的多种方法和优劣三、基本原理：利用浓硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2、H2O逸出，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。然后将消化液用NaOH碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，被硼酸吸收。用标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，从消耗的盐酸标准液计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，消化生成（NH4）2SO4反应式为：H2SO4==SO2↑+H2O+[O]R-CH2-COOH+[O]==R-CO-COOH+NH3↑R-CO-COOH+[O]==nCO2↑+mH2O2NH3+H2SO4==（NH4）2SO42.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中。反应式:(NH4)2SO4+2NaOH→NHOH+Na2SO4→2NH3↑+2H2ONH3+4H3BO3→NH4H2B4O7+5H2O3.再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。反应式：NH4H2B4O7+HCL+5H2O→NH4CL+4H3BO3四、实验试剂及器材：（一）试剂1、硫酸铜（CuSO4·5H20）、硫酸钾——预混粉1.2g2、硫酸（98%）3、硼酸溶液（20g/L）4、氢氧化钠溶液（400g/L）5、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。6、混合指示试剂：（0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合）7、牛奶样品（二）仪器微量定氮蒸馏装置：如图所示。1、电炉；2、水蒸气发生器（500ml平底烧瓶）；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹a；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。五、实验步骤：1、样品消化干燥的凯氏烧瓶：1ml牛奶样品+1.2g预混粉+5mL浓硫酸——摇匀低温300℃内容物全部炭化，泡沫停止升温至450℃保持微沸至液体呈蓝绿色澄清透明继续加热0.5h后取下放冷↓加热消化在通风橱中进行用胶头滴管小心缓慢放冷预混粉：CuSO4：催化剂滴加20mL水NaSO4、K2SO4：提高沸点定容100mL消化液H2O2：加速反应空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。2、定氮装置的检查与洗涤1）洗涤：2~3次，从样品进口入加水（约占反应管三分之一体积）→蒸汽的入口处通水（反应管中的废液倒吸流到反应室外层）→打开夹子b由橡皮管排出2）检查微量定氮装置是否装好3）装管：蒸气发生瓶内装水约三分之二，加3粒玻璃珠以防暴沸；蒸馏液接收瓶中加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性3、碱化蒸馏100ml烧杯：硼酸40mL+混合指示剂4~5滴→反应室：准确吸取10.0mL样品消化液→小玻杯：4mL氢氧化钠→溶液变得混浊不清，且有黑色出现→通入蒸汽蒸腾10min→移动接收瓶，液面离开凝管下端→蒸馏2min，直到小烧瓶中的溶液达到80~90mL→少量水冲洗冷凝管下端外部→以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色→同样做空白试验注意：1）冷凝管的下端插入硼酸液面下2）正式实验时，螺旋夹a关闭3）棒状玻塞应塞紧，旋转玻塞使氢氧化钠其缓缓流入反应室▲5、数据记录项目空白第一次第二次样品消化液（mL）101010滴定消耗盐酸标准溶液（mL）0．4693.5383.600平均消耗标准盐酸溶液（mL）3.569酪蛋白粗提物在牛奶蛋白中比例：0.13/｛C*(V1-V2)*0.01401/(m*10/100)｝=29.9%六、实验结果：蛋白质%=｛C*(V1-V2)*0.01401/(m*10/100)｝*F*100=2.77%样品蛋白质含量（g/100g）V1——样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）V2——空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）C——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）]/000.1)([LmolHClC0.0140——1.0mL盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量（g）m——样品的量g（1mL）F——氮换算为蛋白质的系数，乳制品为6.38七、结果讨论与误差分析：本实验中，经过公式计算，最终得率为2.77%，误差分析如下：1．装置密闭性不好或因螺旋塞夹不紧，部分气体泄露2．滴定过程中存在着滴定误差3．硼酸溶液的吸收不彻底，有少量的一部分进入空气中4．在消化液定容时，在定容过程中，有极少量的损失，如移液后少量残留于消化瓶等移液器材上5．由于对实验的灵敏度问题，两次滴定对于同一个人来说也会不同，使得产生小误差八、注意事项：1、消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。2、硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。3、在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%4、在开始吸收NH3时要，加入NaOH时须小心，缓慢流入，否则造成倒吸，而实验失败。5、消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，在继续加热消化至完全。九、思考题解答：1、蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？答：加入NaOH与消化液中的（NH4）2SO4反应，NH3游离出来，由硼酸吸收。加入的量应该多一些，过少则氨不能完全游离出来，从而造成结果偏低。2、实验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些？答：硼酸温度、定容时是否有损失以及损失的量、加入的NaOH溶液的量等。十、预习时存在问题：1、配制的试剂空白消化液是否参加滴定？参加滴定有何作用？答：试剂空白消化液也参加滴定。除样品之外，其他试剂或水均有可能含N，通过空白试剂的对照，使得样品测N过程中可以扣除空白对照的数据，从而得到较为准确的数据。2、凯氏烧瓶中加小漏斗与不加有何区别？答：从理论上所，加小漏斗有助于热量的散发，对于爆沸引起的样品丧失现象有一定的控制作用。实际上，如果温度控制得好，小漏斗可以不用。3、在反应过程中，反应室内的的液体变成奇怪的蓝色，这是为何？蓝色和褐色有何区别？答：蒸馏时，加入的氢氧化钠溶液除与硫酸铵作用外，还与消化液中的硫酸和硫酸铜作用．若加入的氢氧化钠不够，则溶液呈蓝色，不生成褐色的氢氧化铜沉淀．所以，加入的氢氧化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。4、在蒸汽发生瓶水中、加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸的作用是什么？若在蒸馏过程中才发现蒸汽发生瓶中的水变为黄色，马上补加硫酸行吗？答：加硫酸的作用是保持蒸汽瓶中的水呈酸性。而甲基红则是指示水已呈酸性。实验中再补加硫酸已经没有作用了。十一、结论本次实验采用牛奶样品在凯氏烧瓶中经浓硫酸和催化剂消化后，使蛋白质分解，其中的氮与硫酸作用生成硫酸铵，再在强碱条件下蒸馏出氨，用硼酸吸收，以标准盐酸滴定，根据标准酸消耗的量，乘以一定的系数，就可以计算出蛋白质的含量。本次实验的步骤比较多，比较麻烦，而且也有一定的危险性。例如，取浓硫酸，450度的凯氏烧瓶等。我组的实验出的蛋白质含量为2.77%。与理论值相距一定距离。参考文献：1、《生物化学教程》张洪渊主编，四川大学出版社2、《生物化学实验指导书》倪莉张雯饶平凡编写