金属硫蛋白基本知识

金属硫蛋白1、MT命名及定义根据与MT结合的金属的不同，对只舍一种金属，例如Cd或Cu等，可分别定名为镉金属硫蛋白或铜金属碗蛋白等；还可根据结合金属的摩尔含量写成Cd7–MT、Zn7–MT等(表示每分子结合7个分子Cd或Zn)。对于含一种以上金属，如同时含Cd和Zn时，可写成Cd，Zn-MT。对其分子结构上的差别，可用罗马数字和小写字母标出，例如MT-Ⅱ、MT-Ⅰ、MT-Ⅱa等。经典MT定义：根据金属硫蛋白命名委员会（ThecommitteeontheNomenclatureofMetallothionein）的建议，1988年，Kagi将具有以下特征的蛋白质或多肽定义为MT（Kagi&Schaffer,1988）。1.低分子量，一般为6,000－7,000道尔顿，含60-63个氨基酸残基；2.高金属含量，每分子蛋白质可结合7个二价金属离子，或多至18个一价金属离子；3.特有的氨基酸组成，无芳香族氨基酸及组氨酸；4.富含Cys残基(约23-33%)，无二硫键；特征的氨基酸序列，Cys残基在氨基酸序列中占据相当保守的位置；5.所有的Cys残基均以还原态存在；并通过巯基以硫酯键结合金属离子；从而具有金属巯基化合物的特征吸收光谱。实际上，这只是对经典MT的一个定义。现在MT家族所包括的成员远远超出以上定义的范围。※Cys半胱氨酸2、MT的分类1.1根据MT的结构差异，一般将其分3类第1类：MT的氨基酸序列中的半胱氨酸位置与最先从马肾中分离的MT的氨基酸序列中的半胱氨酸位置紧密相关的多肽。所有哺乳动物的MT都属于这一类。其它来源的MT只要其基本结构与哺乳动物的MT相似亦归这一类。第2类：MT氨基酸序列结构中的半胱氨酸位置与马肾MT关系较远，与哺乳动物MT没有或很少有相似的进化关系。如酿酒酵母和某些高等植物的MT属于这一类。第3类：非典型的MT。是一类由非转译合成的金属硫醇盐多肽，由γ-谷氨酰半胱氨酰基单元组成。这类MT主要来源于真核微生物，常称之为类MT。依据它们之间的差异，又可分为4种类MT：第一类：含大量的酸性氨基酸残基，天冬氨酸含量大于14％，谷氨酸含量大于18％，这类MT仅被Cu、Ag诱导。第二类：它们由同样的肽基亚单位构成，基本结构为γ-谷氨酰肽或称(γ-EC)nG或(γ-Glu-Cys)n-Gly。第三类:MT不舍芳香族氨基酸，分子量为9～9.5kD。第四类：MT的分子量为7kD，具有重复Cys-Xaa-Cys多肽序列的二分子。※巯(qiu)基-有机化合物中含硫和氢的基，通式为-SH3、金属硫蛋白的诱导用于诱导MT试验的动物很广泛。小鼠因其来源广、价廉常被用来做诱导MT试验。此外，田晓光等利用舍蝇幼虫提取了金属硫蛋白，发现每克舍蝇幼虫中约含金属硫蛋白0.8mg，此结果显示，舍蝇可以用于提取金属硫蛋白。郭祥学等用锌诱导蓝藻也成功分离出了类金属硫蛋白。而兔子因具有来源广、价廉、易饲养、MT产率高等优点而常用于MT制备的诱导，其中尤以青紫兰家兔因其耐受性强而广泛应用。目前，诱导金属硫蛋白有如下几种方法：金属诱导、激素与应激诱导、在疾病状态下诱导等。⑴金属诱导MT。许多金属如Cu、Ag、Au、Zn、Hg、Cd、C0、Ni、Al等均能诱导MT的合成。大量研究表明，动物注射金属诱导后，其肝、肾、脾、肠等器官内MT的含量增加。Cd、Hg诱导金属硫蛋白的能力较强，而Zn稍弱。余美祥等给家兔注射CdC1，在肝脏中提取MT得到了良好的结果。但Cd对生物体有害，而去掉Cd的方法复杂，故此元素的应用受到一定的限制。目前的医药试验是通过直接注射ZnSO诱导MT合成，所得MT完全是Zn—MT。郝守进等发现外源性的Zn诱导兔肝金属硫蛋白含量显著提高。⑵激素与应激对MT的诱导。肝脏是MT表达的主要场所。给兔注射激素，如糖皮质激素、胰高血糖素、肾上腺素等均能增加兔肝MTmRNA水平，从而使肝脏中MT合成增加。此外，各种生理、病理或心理应激状态，以及炎症因子、机体的应激状态也能增加兔肝MTmRNA的转录，同时伴有血浆中Zn浓度的下降。目前，已有试验发现，应激能激活下丘脑一垂体肾上腺轴，引起糖皮质激素和儿茶酚胺的增加。这些物质能调节组织中(包含它们的感受器1不同目标基因的表达。而肾上腺轴被激活后，对提高MT-I和MT-1I基因表达至关重要。同时有些数据分析表明，面对抑制性心理应激，组织通过增加MT-I和MT-Ⅱ基因的表达，能有效抵抗应激的有害影响。⑶疾病状态下诱导MT。通过由增殖性因素刺激皮肤。对正常皮肤增生的表皮组织及增生的病损皮肤区域染色，发现MTmRNA表达增加，这表明MT在表皮角质细胞的增生过程中发挥作用。另有试验发现，在皮肤伤处于早期急性阶段的细胞中MTmRNA表达增加。兔的外科手术中发现，随着局部使用氧化锌、氯化镉、硝酸银后，会出现局部Zn浓度的积聚和伤口边缘基质细胞MT的释放，使用氧化锌、硝酸银的兔子和对照组相比伤口愈合较快，这一点也给临床药物开发提供了潜在的治疗价值。肿瘤组织、癌组织和患有心血管系统疾病及中枢神经系统(CNS)疾病的动物组织中MT的含量普遍提高，目前在国外已有试验试图通过疾病提取诱导MT，但试验方法有待于进一步优化，这将为以后人们对硫蛋白的提取提供新的思路。⑷转基因诱导表达MT。有人把结合重金属离子能力很强的小鼠MT-I基因(mMT-IcDNA)与蓝藻类金属硫蛋白基因启动子(smtO-P)构成金属调控单元，导入聚胞藻PCC6803中进行金属诱导表达和纯化mMT-I。在做小批量锌诱导表达和纯化了外源蛋白后，检测了转基因对于提高蓝藻金属离子耐受能力的作用，这为基因工程制药进行了有益的研究与探索。张晓钰等用另一个α结构域取代金属硫蛋白的β结构域，得到金属硫蛋白αα突变体后，再使这个突变体αα-cDNA在烟草中表达，发现αα-cDNA在烟草根部的表达强于叶部，同时，转基因烟草对Cd+抗性提高。而人们应用此方法对于兔肝中金属硫蛋白的提取尚在探索之中。4、MT的分离纯化分离纯化MT的常用方法是凝胶过滤和离子交换技术相结合的层析法，微量分离可以采用HPLC法,但是凝胶过滤法不能将MT的不同“亚型”分开。KIaassen等建立的阴离子交换的HPLC-AAS法可将MT的亚型分开,KIauserdeng建立的反相HPLC法可分离不同来源的MT。此外，也有采用DEAE-Sepharosefastflow方法分离MT的。这些分离纯化方法有其明显的优点，但也有不足之处，如何建立简便分离纯化MT的方法仍是一个热门课题。凝胶过滤层析和离子交换层析技术相结合的是最常用的兔肝金属硫蛋白的分离纯化方法。分离纯化的一般流程为：粗分、拆分和脱盐。不同种属、不同组织MT的分离纯化存在一定的差别，兔肝中常用两次离子交换层析张保林等则利用了MT强热稳定性这一特点，预先对萃取液进行热处理，以除去大部分杂蛋白，从而经一次凝胶分离，一次离子交换拆分得到了高纯度的MT—I和MT一Ⅱ，不仅简化了试验过程，也避免了多一次离子交换层析造成的样品损失，提高了回收率。在对兔肝金属硫蛋白的分离中，微量分离常采用HPLC与阴离子交换的HPLC-AAS法，大量制备MT则增大层析面积即可。另外，也有采用DEAE-SepharoseFastF1ow凝胶来分离金属硫蛋白，由于该凝胶具有流速快、容量大，而且溶涨体积不受缓冲液离子强度变化影响等优点，所以每次用完后，不需重新装柱。将二价铜离子螯合在ChelatingSepharoseFastFlow凝胶上制成亲和层析柱的方法，锌诱导兔肝和镉诱导小鼠肝经匀浆、乙醇处理后上柱，用pH值4.0的醋酸盐缓冲液平衡，再用pH值5.2不同浓度的醋酸盐缓冲液洗脱，可得MT-I和MT-II两个洗脱峰，此法比传统的凝胶过滤一离子交换法简单、省时、适于实验室规模分离纯化。5、MT的检测方法现有的检测方法都是建立在MT的理化特性以及免疫学特性基础上。可分为以下几类：⑴测定结合金属以计算MT的含量，如镉血红蛋白饱和法和银血红蛋白饱和法；⑵测定SH基以计算MT的含量，主要有微分脉冲极谱法和循环伏安法；⑶测定蛋白含量：包括免疫学方法，如RIA,ELISA等；还有色谱分析法,如HPLC和HPLC-AAS法。从方法学上讲，测定组织器官中的的MT含量，首推HPLC-AAS和血红蛋白饱和法，测定血液的MT含量，选用RIA和ELISA法为佳。6、一般理化特性研究表明不同来源的MT的分子量一般为6500道尔顿,去除金属后即硫蛋白分子量（thionein）为6000道尔顿。从不同哺乳动物的组织中提取的MT的分子大小和形状基本是一致。从粗糙链孢霉菌(Neurosporacrossa)中分离出的MT，其分子量比哺乳动物的MT低得多（只有25个氨基酸残基），但基本结构十分相似。使各种金属硫蛋白中50%的金属离子发生解离的pH为：Zn-MT，PH3.5-4.5；Cd-MT，PH2.5-3.5；Cu-MT的PH低于1。脱掉金属后的硫蛋白在低PH值是很稳定的,但当PH调至中性时,通过二硫键的形成,蛋白分子间很快被相互交联而形成不同大小的分子。因此,金属硫蛋白的存在形式及稳定性与它所结合金属的种类、是否结合了金属及环境的PH密切相关。金属硫蛋白的光吸收特征除了与它的氨基酸组成有关外,也与它所结合的金属种类密切相关。因蛋白分子中不含芳香族氨基酸,所以它没有280nm的吸收峰,只具有与金属结合而产生的特征吸收峰：Zn-MT为220nm；Cd-MT为250nm；Cu-MT为270nm。在脱掉了金属后,硫蛋白在190nm处有一明显的肽键吸收峰。7、MT的结构特性根据已测定的几种不同生物的MT氨基酸序列可发现，它在生物进化上是很保守的，尤其是哺乳类动物的MT均含61个氨基酸残基，其中有38个相同，完全缺乏芳香族氨基酸和组氨酸,氨基末端皆为N-乙酰蛋氨酸，羧基末端皆为丙氨酸，更为惊奇的是所有这些MT都有20个半胱氨酸。但从另一些生物中分离出的MT的氨基酸组成与以上所述有一些差别，如从稻类作物根部分离到的MT,分子量只有5600道尔顿，氨基酸组成中含44%半胱氨酸和39%的谷氨酸。另外,大多数哺乳动物组织中都含有两种以上的“亚型”,如小鼠肝脏分为MT-1和MT-2，而人肝脏中分离到的“亚型”至少有四种以上。这种“亚型”只是在离子交换层析分离时才能分开，因为它们之间所带电荷略有微小的差异。8、MT的空间结构通过圆二色性和晶体结构研究发现,金属硫蛋白分子中不含α-螺旋和β-折叠片,而存在一种十分坚固的构象,因此，它具有很强的抗热性和抵抗蛋白酶消化的能力。MT的三级结构以两个结构域(Domain)为特征，即分子前半部(氨基端头30个氨基酸残基)为β结构域，分子后半部(羧基端30个氨基酸残基)为α结构域，彼此都单独呈球状，两者通过第30和31位氨基酸残基连接使整个MT分子呈哑铃状。晶体结构分析表明,在这两个结构域内,为了更适于结合金属，多肽链盘绕着金属离子而各形成三个回折。β区9个半胱氨酸残基结合3个原子的Zn或Cd或6个原子的Cu；α区11个半胱氨酸，可结合4个Zn或Cd或结合5-6个原子的Cu。金属离子全与所有半胱氨酸的巯基结合,因此，天然的MT分子不含二硫键，也没有自由的巯基存在，在每个区中Zn或Cd都是以二价状态和4个半胱氮酸的巯基相结合,形成〔金属2+（Cys-）4〕2-复合物而使得整个分子带负电，但Cu则是以一价的形式结合。9、MT金属结合位点重金属离子与MT结合的相对亲合性不一样,Cu的稳定系数要比Cd大100倍，而Cd又比Zn大1000倍,Hg和Ag又比Cu稳定得多，即与蛋白结合的稳定性依次为Hg和Ag＞Cu＞Cd＞Zn。在PH很低的情况下,金属离子从MTs上脱落而产生无金属的硫蛋白。体外金属重建实验表明：其和α和β结构域对Cd的络合常数相差约1000倍，即Zn和Cd首先和α区结合，然后才结合β区，但Cu则正好相反，不同的金属在完成结合时呈现出协同效应,即在同一结构域内,当一个金属离子结合后可促进另外其它金属离子的结合,而不是两个结构域同步结合。从组织中分离到的天然的MT金属成分很少是单一的,甚至用金