金黄色葡萄球菌检验.

金黄色葡萄球菌检验概况•葡萄球菌属微球菌科，本菌有19个菌种，从人体上可检出12个种。•葡萄球菌属主要与皮肤腺体和温血动物的粘膜相关系，有些种是人及动物的条件致病菌。•金黄色葡萄球菌对人类有致病性，通常被称为病原性球菌。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，又称为化脓性球菌。金黄色葡萄球菌的生物学特性形态与染色：•金黄色葡萄球菌的典型形态呈球形，直径0.4～1.2µM，大小不一，平均直径约为0.8µM。•革兰氏染色阳性，呈葡萄串状排列。无鞭毛、无芽胞。在陈旧培养物中，衰老的菌体常转为革兰氏阴性。培养特性：•易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。•需氧或兼性厌氧。•最适生长温度37℃，最适生长PH7.4。耐盐性强，在含10～15%的氯化钠培养基中仍能生长，可用于筛选菌种。•在普通营养琼脂平板上培养18～24Ｈ，可形成圆形、表面光滑、不透明的菌落。可产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。•在血平板上可形成明显透明的溶血环。为Β型溶血。•可产生卵磷脂，在卵黄高盐培养基上形成周围有白色沉淀环的菌落。•大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红试验、VP试验多为阳性，不产生靛基质。触酶阳性。金黄色葡萄球菌的酶•金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶和耐热DNA酶。这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。•血浆凝固酶：与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关。一般认为，血浆凝固阳性的金黄色葡萄球菌菌株有致病力。否则为无力的菌株。血浆凝固酶对热稳定，能抵抗60℃30MIN甚至100℃30MIN后，仍能保存大部分活性。•耐热DNA酶作为除血浆凝固酶外鉴定金黄色葡萄球菌致病力的指标之一。该酶的最适PH为9.0。•金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一种重要的致病物质。本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。•近年报导表明，50%以上的金黄色葡萄球菌菌株在实验室条件下可产生肠毒素，并且1个菌株能产生两种或两种以上的肠毒素。•肠毒素是一种可溶性蛋白质，由单个无分枝的肽链组成。分子量约为3000左右。易溶于水，难溶于有机溶剂。金黄色葡萄球菌的肠毒素•耐热，经100℃煮沸30MIN不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。食物中的肠毒素耐热性更强，一般烹调温度不能将其破坏。218~248℃的油中需30MIN才能被破坏。可引起急性胃肠炎。•根据肠毒素的血清型，可分A、B、C（C1、C2）、D、E5个型。A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。其他依次为D、C、B和E型。也有A＋D、A＋B、A＋C、B＋C等。•A型肠毒素毒力较强，摄入1ΜG即可引起中毒；B型毒力较弱摄入25ΜG，才引起中毒。一般认为引起人中毒的最小剂量是1.0~7.2ΜG/KG。金黄色葡萄球菌的检测程序检样25g(mL)＋225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤36±1℃Baird-Parker平板，血平板涂片染色观察溶血血浆凝固酶试验报告血平板18~24h，Baird-Parker平板18~24h或45~48h。BHI肉汤和营养琼脂小斜面36±1℃18~24h增菌培养基•7.5%氯化钠肉汤：为葡萄球菌选择性增菌培养基，因金黄色葡萄球有耐受高盐的特性，因而能在此增菌液中生长，除某些嗜高盐的海洋菌外，大多数细菌都被增菌液中的高盐所抑制。•胰酪胨大豆肉汤：含氯化钠达10%，以胰酪胨替代牛肉浸粉，并加入少量磷酸氢二钾和葡萄糖促进葡萄球菌的生长。样品的稀释•固体和半固体样品：称取25G样品至盛有225ML磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000R/MIN～10000R/MIN均质1MIN～2MIN，或放入盛有225ML稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1MIN～2MIN，制成1:10的样品匀液。•液体样品：以无菌吸管吸取25ML样品至盛有225ML磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。增菌与分离培养•增菌培养：吸取5ML上述样品匀液，接种于50ML7.5%氯化钠肉汤或10%胰酪胨大豆肉汤培养基内，36℃±1℃培养18H～24H。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。•将上述培养物，分别划线接种到BAIRD-PARKER平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18H～24H。BAIRD-PARKER平板36℃±1℃培养18H～24H或45H～48H。分离培养基•BAIRD-PARKER琼脂：培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色和晕圈。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金黄色葡萄球菌的生长。•金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约2~3MM，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶而可见无混浊带和透明圈的非典型菌落。•长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。分离培养基•血琼脂：是一种基础培养基，含有5%的脱纤维血(羊血或兔血)。用于观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上呈Β溶血。•金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色，有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、表面光滑，周围有透明的Β溶血环。革兰氏染色血浆凝固酶试验•试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤蛋白，附着于细菌表面，产生凝固。•金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶：一种是与细胞壁结合的凝固酶，为结合凝固酶；另一种是菌细胞释放于培养基中，为游离凝固酶。二者的抗原性不同。血浆凝固酶试验•挑取BAIRD－PARKER平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5MLBHI和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18H～24H。•取新鲜配置兔血浆0.5ML，放入小试管中，再加入可疑菌落的BHI培养物0.2ML～0.3ML，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6H，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，判定为阳性结果。•同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。•结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5MLBHI，36℃±1℃培养18H～48H，重复实验。结果报告•如血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡萄球菌。•报告在25G（ML）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。谢谢!