骨髓基质干细胞与癫痫细胞凋亡的相关性

中国组织工程研究第20卷第28期2016–07–01出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJuly1,2016Vol.20,No.28ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4117·研究原著·王浩，男，1976年生，河南省商水县人，汉族，2008年暨南大学毕业，硕士，主治医师，主要从事癫痫和神经内科方面的研究。中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)28-04117-06稿件接受：2016-05-16骨髓基质干细胞与癫痫细胞凋亡的相关性王浩，任向阳，马聪敏，黄超，周海涛(郑州大学附属洛阳中心医院神经内科，河南省洛阳市471000)引用本文：王浩，任向阳，马聪敏，黄超，周海涛.骨髓基质干细胞与癫痫细胞凋亡的相关性[J].中国组织工程研究，2016，20(28):4117-4122.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.002ORCID:0000-0002-5383-9235(王浩)文章快速阅读：文题释义：细胞凋亡：细胞凋亡指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，结束自己生命的过程。细胞凋亡属于一种细胞程序性死亡，从基因角度进行分析，在一定的条件下，细胞内一些相关基因被启动，便会激活相应的内源性DNA内切酶，导致细胞的主动性死亡。癫痫：是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。摘要背景：癫痫与细胞凋亡之间密切相关，癫痫的发生会导致海马神经元出现丢失现象和凋亡，引发一系列程序性细胞死亡的出现。目的：观察骨髓基质干细胞移植治疗癫痫对细胞凋亡产生的影响。方法：45只SD大鼠制备癫痫模型，随机分为3组，即癫痫未移植组、生理盐水组和骨髓基质干细胞组，分别实施未移植治疗和生理盐水注射治疗以及骨髓基质干细胞移植治疗。造模后1，2，4周，免疫组织化学法检测3组动物脑组织Bax阳性细胞数、Bcl-2阳性细胞数及Bax/Bcl-2情况。结果与结论：①不同时间生理盐水组Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2值均未出现明显的改变；②造模后1，2，4周，骨髓基质干细胞组与癫痫未移植组和生理盐水组比较，骨髓基质干细胞组Bax阳性细胞数、Bax/Bcl-2值均出现显著的下降，Bcl-2阳性细胞数则出现显著的增加(均P0.05)，骨髓基质干细胞组造模后不同时间组内比较，差异有显著性意义(均P0.05)；③结果表明，骨髓基质干细胞移植能下调癫痫大鼠脑组织促凋亡因子Bax阳性细胞数，上调抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数，提示其对癫痫所导致的细胞凋亡产生一定的影响，可能减少癫痫所致细胞凋亡的出现。关键词：干细胞；骨髓干细胞；癫痫；骨髓基质干细胞；干细胞移植；细胞凋亡主题词：干细胞；癫痫；细胞凋亡；组织工程CorrelationbetweenbonemarrowstromalstemcellsandapoptosisinepilepsyWangHao,RenXiang-yang,MaCong-min,HuangChao,ZhouHai-tao(DepartmentofNeurology,AffiliatedCentralHospitalofLuoyang,ZhengzhouUniversity,Luoyang471000,HenanProvince,China)骨髓基质干细胞移植治疗癫痫对细胞凋亡产生的影响制备癫痫模型癫痫未移植组生理盐水组骨髓基质干细胞组45只SD大鼠未移植治疗骨髓基质干细胞移植治疗免疫组化法检测生理盐水注射治疗王浩，等.骨髓基质干细胞与癫痫细胞凋亡的相关性P.O.Box10002,Shenyang110180:Thereisacloserelationshipbetweenepilepsyandapoptosis.Theappearanceofepilepsycanleadtothelossofneuronsinthehippocampus,triggeringaseriesofprogrammedcelldeath.OBJECTIVE:Toinvestigatetheeffectofbonemarrowstromalstemcelltransplantationonapoptosisinepilepsy.METHODS:Aftermodeledtobeofepilepsy45,Sprague-Dawleymodelratswererandomlydividedintothreegroups,followedbygivennointervention(moldelgroup),normalsaline(normalsalinegroup)orbonemarrowstromalstemcelltransplantation(transplantationgroup).At1,2and4weeksaftermodeling,thenumberofBax-positivecells,Bcl-2-positivecellsandBax/Bcl-2weredetectedbyimmunohistochemistry.RESULTSANDCONCLUSION:ThenumberofBax-positivecells,Bcl-2-positivecellsandBax/Bcl-2presentednoobviouschangesinthenormalsalinegroupatdifferenttimepoints.However,thenumberofBax-positivecellsandBax/Bcl-2inthetransplantationgroupwassignificantlydecreased,whilethenumberofBcl-2-positivecellssignificantlyincreasedcomparedwiththeothertwogroupsat1,2and4weeksaftermodeling(P0.05).Moreover,theaboveindicatorsvariedsignificantlyinthetransplantationgroupatdifferenttimepointsaftermodeling(P0.05).Theseresultsshowthatbonemarrowstromalstemcelltransplantationcanaffecttheapoptosisandeffectivelyreducetheapoptosisinratswithepilepsybyup-regulatingthenumberofBax-positivecellsanddown-regulatingthenumberofBcl-2-positivecells.Subjectheadings:StemCells;Epilepsy;Apoptosis;TissueEngineeringCitethisarticle:WangH,RenXY,MaCM,HuangC,ZhouHT.Correlationbetweenbonemarrowstromalstemcellsandapoptosisinepilepsy.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(28):4117-4122.0引言Introduction癫痫是一种严重危害人体健康的疾病，但是，长期以来缺乏治疗癫痫有效的方法[1]。自从癫痫在人类中出现之后，人们就饱受着病痛的折磨。以往的治疗大多采用药物或者手术方式，但均无法对受损的神经细胞予以有效的修复，无法获得理想的治疗效果[2]。随着细胞生物技术的发展，干细胞移植治疗癫痫成功的解决了病变的大脑神经元异常放电的情况[3]。干细胞是一类具有自我复制能力的未充分分化细胞，医学界称为“万用细胞”。通过干细胞移植，具有分化能力的细胞可以在特定部位发生分化，并对疾病所致受损细胞予以良好的修复。因此，利用干细胞移植方式治疗癫痫等神经性疾病，可以从病变的基础上修复异常放电的大脑神经元，获得良好的且持久的效果，有效避免病情反复发作等的出现。干细胞移植过程中，骨髓基质干细胞移植是一种常用的细胞来源。癫痫与细胞凋亡之间密切相关，癫痫的出现会导致海马神经元出现丢失现象和凋亡，引发一系列程序性细胞死亡的出现[4-5]。以往有学者报道，癫痫大鼠会出现神经元凋亡现象[6]，分析其分子机制，是因为在海马CA3区凋亡相关蛋白p-c-Jun的介导下，形成应的核通路，并与Bcl-2介导的非核通路一起，共同对海马神经元细胞产生影响，并导致其凋亡。通过干细胞移植治疗，可能会对疾病所致神经细胞凋亡产生一定的影响，进而达到治疗疾病的目的。但是，以往关于骨髓基质干细胞移植对癫痫所致细胞凋亡的影响相关研究较少。为此，实验通过检测细胞凋亡相关指标Bax阳性细胞数、Bcl-2阳性细胞数及Bax/Bcl-2情况，探讨骨髓基质干细胞移植治疗癫痫对细胞凋亡产生的影响。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞学实验观察。1.2时间及地点实验于2015年10至12月在郑州大学附属洛阳中心医院实验室完成。1.3材料实验动物：SD大鼠45只，雌雄不限，体质量300g左右，健康状况均良好，并饲养于郑州大学附属洛阳中心医院动物中心SPF环境，许可证号SYXK(京)2015-0008。GFP转基因小鼠5只，雌雄不限，6-8周龄，体质量40g左右，用于进行骨髓基质干细胞分离培养。研究相关方案均提交本院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。试剂与仪器：青霉素广州白云山天心制药股份有限公司)；胰蛋白酶(上海信帆生物科技有限公司)；多聚甲醛(上海甄准生物科技有限公司)；蔗糖溶液(南京安培化工科技有限公司)；立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；倒置显微镜(北京中仪光科科技发展有限公司)；光学显微镜(北京中仪光科科技发展有限公司)。1.4实验方法1.4.1大鼠癫痫模型制备[7]45只SD大鼠均制备癫痫模型，用生理盐水稀释青霉素至浓度为80×104u/mL，对动物进行腹腔注射，每只动物均连续注射7d。观察王浩，等.骨髓基质干细胞与癫痫细胞凋亡的相关性ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4119大鼠行为改变情况，每次癫痫发作按照Racine标准进行评分，发作过程均利用摄像机进行记录。最终，所有动物均成功制备癫痫模型。1.4.2实验分组将动物随机分为3组：癫痫未移植组(15只)、生理盐水组(15只)、骨髓基质干细胞组(15只)，分别实施未移植治疗和生理盐水注射治疗以及骨髓基质干细胞移植治疗。1.4.3骨髓基质干细胞分离培养与鉴定[8]脱颈法处死小鼠，乙醇中浸泡5min，获得GFP转基因小鼠股骨，利用PBS进行冲洗后，提取骨髓基质细胞，对细胞进行常规培养与鉴定。传代培养，并收集P3细胞，添加抗体CD44和CD45，进行免疫组化染色和观察。收集P5代细胞添加胰蛋白酶进行消化，制备细胞悬液。对细胞悬液进行离心，调整细胞浓度为1×105L-1，保存备用。1.4.4分组治疗[9]生理盐水组与骨髓基质干细胞组均在大鼠模型癫痫发作7d后进行治疗。骨髓基质干细胞组利用立体定位仪进行准确定位，利用微量注射器对海马区进行骨髓基质干细胞悬液注射，细胞浓度为1×105L-1，注射剂量5μ