链霉菌属磷脂酶D的底物识别机制和缩醛磷脂的酶法测定

链霉菌属磷脂酶D的底物识别机制和缩醛磷脂的酶法测定YusakuMatsumotoandDaisukeSugimori*DepartmentofSymbioticSystemsScienceandTechnology,GraduateSchoolofSymbioticSystemsScienceandTechnology,FukushimaUniversity,1Kanayagawa,Fukushima960-1296,JapanReceived8January2015;accepted28February2015Availableonlinexxx摘要本文研究了链霉菌属磷脂酶D的底物识别机制和胆碱缩醛磷脂的酶法测定。来自链霉菌属NA684菌株的磷脂酶D（PLD684）从培养的上层清夜中进行纯化，最终得到的酶比活力提高了184倍，总活力的回收率为23.7%。在pH为5.0，温度为80℃时获得对L-α-溶血卵磷脂（LPC）的最大水解活力。反应混合物中TritonX-100的浓度对水解活力的影响十分显著。当含有0.05-0.5%和0.1-0.2%（湿重/体积）的TritonX-100时，2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱（POPC）和胆碱缩醛磷脂分别被PLD684有效水解。LPC和胆碱溶菌酶缩醛磷脂不需要TritonX-100；当TritonX-100含量超过0.05%时，水解活力反而被抑制。相比于脂质体单体底物，酶更优先与混合胶束类底物结合，1小时内对混合胶束底物的水解率达到98.4%。动力学分析表明，混合胶束POPC和乳化的LPC水解反应的速率限制步骤分别为bulkstep和thesurfacestep。这一结论表明，PLD684在识别由于磷脂质不同的头部和尾部造成具有不同物理性质的底物时，有至少两种底物识别机制。了解PLD684如何识别底物类型，对阐明自然中解脂蛋白的作用是非常有用的。此外，我们还报道了利用PLD684和磷脂酶B进行酶法测定胆碱缩醛磷脂含量。这是第一次利用酶法测定胆碱缩醛磷脂含量。关键词链霉菌属；磷脂酶D；动力学；函数式；底物识别；缩醛磷脂的测定前言磷脂酶D催化甘油磷脂中磷酸二之键的断裂水解，形成磷脂酸和相应的醇。一些PLD具有转酯活力。例如，在乙醇胺存在的环境下，卵磷脂（PC）转化为磷脂酰乙醇胺（PE）。一些来自链霉菌属（包括链霉菌antibioticus，链霉菌cinnamoneum，链霉菌halstedii，链霉菌septatus和链霉菌PMF菌株）的PLD已经进行了测序。这些PLD都属于PLD总科，显示出显著的序列相似性，都含有两个成为HKD基元的HxKxxxxD序列。Leiros等人做出来了来自链霉菌属PMF的PLD的晶体结构。PLDPMF是一种单体蛋白质：由两个具有相似拓扑结构的域组成。晶体结构和突变研究揭示了底物结合方式。然而，PLD对胶束形式的底物识别机制还不确定，只知道相比于单体底物，PLD通常更倾向于与聚合形底物进行结合。之前的研究已经说明了PLD的活性取决于底物形式，例如脂质体单体，乳化的脂质体或混合胶束底物。PLD在胶束型底物的界面处表现出最高的活性，与胶束形式和单体底物相比，PLD对磷脂囊的活性显著降低。因此，底物的形式是决定酶活的关键。但是PLD是如何识别底物形式的尚不清楚。为了清楚底物识别机制，对解脂蛋白提出了一个新看法。在当前的研究中，我们报道了来自链霉菌属NA684菌株的磷脂酶PLD684对脂质体单体，乳化的脂质体或混合胶束底物的水解活力。此外，我们演示了在有TritonX-100时，对混合的PC胶束和乳化的LPC这种不同底物的识别机制和酶法测定胆碱缩醛磷脂。药品及研究方法药品L-α-溶血卵磷脂，鸡蛋（LPC），1-十六酰基-2-油酰-锡-丙三醇-3-磷脂酰胆碱（POPC），1-O-1′-(Z)-油胺-2-羟基-锡-丙三醇-3-磷脂酰胆碱（胆碱溶血缩醛磷脂，LPLS-PC），1-（1Z-油胺）-2-四烯酸-锡-丙三醇-3-磷脂酰胆碱（胆碱缩醛磷脂，PLS-PC），1-十六酰基-2-油酰-锡-丙三醇-3-磷脂酰乙醇胺（POPE），1-O-1′-(Z)-油胺-2-羟基-锡-丙三醇-3-磷脂酰乙醇胺（乙醇胺溶血缩醛磷脂，LPLS-PE），1-（1Z-油胺）-2-四烯酸-锡-丙三醇-3-磷脂酰乙醇胺（乙醇胺缩醛磷脂，PLS-PE），1-十六酰基-2-油酰-锡-丙三醇-3-磷脂酰甘油（POPG），L-α-溶血磷脂酰乙醇胺（LPE），L-α-磷脂酰肌醇（PI），产自鸡蛋黄的鞘磷脂（SM），锡-甘油-3-磷脂酰胆碱（GPC），细菌蛋白胨，ToyopearlPhenyl-650M，HiTrapQHP，RESOURCEPHE和MonoS色谱柱，胆碱氧化酶（COD），过氧化物酶（POD）4-氨基安替比林，N，N-二（4-磺丁基）-3-甲基苯胺的二钠盐（TODB）重组的PLD（PLD684），其他药品均为最高级或分析级纯。菌株，质粒和培养条件从日本福岛的土壤样本中分离出来链霉菌属NA684。NA684菌株在28℃，5mL3%（湿重/体积）的TSB中培养48小时，震荡（160转/分钟）。在500mL锥形瓶中加入100mL3%（湿重/体积）的TSB培养基，取1mL上述培养液转移到此锥形瓶中，28℃摇床培养48小时（180转/分钟）。大肠杆菌HST08感受态细胞作为基因克隆的宿主。pGEM-T载体和pMD20-T载体作为载体。重组的大肠杆菌细胞在37℃下培养于LB琼脂板上；如果有必要，可在琼脂培养基中加入安比西林，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和X-半乳糖苷。从生物资源中心获得的变铅青链霉菌1326（NBRC15675）作为PLD684表达的宿主。pUC702作为表达载体。重组的铅青链霉菌细胞培养在含有5μg/mL硫链丝菌素的3%（湿重/体积）的TSB中，28℃摇床培养48小时（180转/分钟）。PLD684的纯化所有程序都在4℃下进行。培养48小时后，通过离心分离获得上清液（18800xg,10min）。产生的上清液置于含有A缓冲液（20mMTtis-HCL缓冲液，pH8.0）的80%硫酸铵溶液中.4℃下培养2小时，离心分离收集沉淀（18800×g，10min）。对酶样品进行离心（21800×g，10min）除去不可溶物质。为了获得上清液，将硫酸铵加到1M，并将这个样品加入到toyopearl苯基-650M的柱子（2.5×3.5cm）中，用含有1M(NH4)2SO4的A缓冲液进行平衡。柱子用相当于3倍柱体积的1M(NH4)2SO4/缓冲液，流速为10mL/min(2cm/min)进行洗脱。收集有效部位，此时，缓冲液换为缓冲液B(20mMTriseHCl,pH9.0)，装载到1mL的MonoQ色谱柱中，并用缓冲液B进行平衡。过完柱子之后洗三遍（3CV），以1mL/min含有0-1MNaCl的缓冲液B线性洗脱蛋白质(20CV)。收集活性部位，缓冲液换为1M(NH4)2SO4/缓冲液A，样品装载到1mL的RESOURCEPHE色谱柱中，并用1M(NH4)2SO4/缓冲液A进行平衡。过完柱子之后洗三遍（3CV），以2mL/min含有0.1-0.2M(NH4)2SO4的缓冲液B线性洗脱蛋白质(40CV)。收集活性部位，缓冲液换为C（20mMMES-NaOH，pH6.0），样品装载到1mL的MonoS色谱柱中,并用缓冲液C进行平衡。过完柱子之后洗三遍（3CV），以1mL/min含有0-0.5MNaCl的缓冲液C线性洗脱蛋白质(40CV)。收集表现出高比活的部分进一步研究。PLD活性的检测包含50mM醋酸盐缓冲液（pH5.6），0.8mMLPC和10%(vol/vol)酶液的标准测定混合物（50μL），65℃培养下5min，加热到100℃，5min终止反应。离心分离之后（21800×g，1min），200μL包含0.03%4-氨酰安替比林，0.02%TODB，0.75U/mLCOD和5U/mLPOD的比色溶液加入到酶反应混合物中，来测定酶促反应释放胆碱的浓度。一个单元（U）的酶活定义为磷脂底物每分钟释放1μmol胆碱。pH和温度对PLD活性的影响用不同缓冲液（醋酸盐，Bis-Tris-HCl,Tris-HCl和甘氨酸-NaOH）来研究pH对酶活和稳定性的影响。在具有0.8mMLPC的50mM缓冲液中，37℃下培养5min来确定最适酸碱度酸碱稳定性鉴定。通过4℃下，45mM缓冲溶液中培养酶12小时。60℃下，在pH为5.0的具有0.8mMLPC的50mM醋酸盐缓冲液中培养5min，测量残留的酶活。在pH为5.0的具有0.8mMLPC的50mM醋酸盐缓冲液中培养5min，在每个温度下测量酶活确定最适温度。将酶在50mM，HEPES-NaOH（pH7.5）中，各温度下培养60min来测定其热稳定性，60℃下，在pH为5.0的具有0.8mMLPC的50mM醋酸盐缓冲液中培养5min，测量残留的酶活。所有实验分别进行三次。底物专一性存在不同浓度TritonX-100的条件下，研究酶对胆碱磷脂质的底物专一性（POPC,LPC,PLS-PC和LPLS-PC）。在37℃下，在具有不同浓度TritonX-100的pH为5.0的具有0.8mM底物的50mM醋酸盐缓冲液中培养5min，测定酶活。研究磷脂质头部基团对水解活力的影响（POPC,POPE,POPG和PI）。酶促反应在37℃下，在具有609ng-蛋白质/mL（2.27mU）的纯PLD684(LPC372U/mg-蛋白质)，含有15.9mMTritonX-100的5mM混合胶束底物或含有脂质体底物的50mMpH为5.0醋酸盐缓冲液，反应5min。反应混合物中的剩余底物（100μL），用400μL体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液萃取。氯仿相蒸发掉之后，将剩余的物质溶解在20μL体积比为4:1的氯仿-甲醇溶液中，多余的磷脂质用InertsilNH2柱子分离，并用高效液相色谱在215nm处检测。洗脱剂用乙醇：CH3CN：10mMNH4H2PO4(体积比为50:40:10，pH5.8)。柱子保持40℃，泵的运行流速为0.4mL/min。所有实验分别进行三次。动态光散射分析如POPC和LPC等底物与TritonX-100作用形成混合胶束或乳化剂。基于DLS，其粒径分布通过粒度分析仪进行测量。DLS测量在37℃下进行，胶束粒径分布通过SZ-100Z计算设备进行分析。稳态动力学纯化的酶用来做稳态动力学分析。对POPC的水解，酶促反应的初速度由POPC/TritonX-100（1:3）的浓度决定。酶浓度恒定为60.9ng-蛋白质/mL。对LPC的水解，酶促反应的初速度由不含TritonX-100的LPC浓度决定。酶浓度恒定为244ng-蛋白质/mL。LPC的浓度（[LPC]）以分子量为503.33进行计算。酶促反应在37℃下50mM醋酸缓冲液中（pH5.0）进行5min。动力学参数Km,Vmax和kcat由米氏方程对不同浓度POPC和LPC初速度的非线性数据决定。PLD684的kcat值以一个单体蛋白质和一个活性中心分子量为54000进行计算。所有实验分别进行三次。蛋白质分析蛋白质浓度以BSA作为标样，用双锌丁酸蛋白质分析法测定。纯PLD684的分子量通过和蓝色聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行分析，估计。排阻色谱利用一个Superdex20010/300GL的柱子，将含有0.15MNaCl的20mMTris-HCl（pH8.0）以0.5mL/min的流速通入。色谱柱用标准蛋白凝胶过滤校准。BN-PAGE和SDS-PAGE分析分别按厂家说明进行操作。在氨基酸序列内部，蛋白质离开SDS-PAGE凝胶，被胰蛋白酶消化，根据Shevchenko等人的方法，对获得的氨基酸进行萃取。萃取出来的氨基酸，根据之前报道的方法，利用nanoAcquityUPLCBEH130C18和XevoQTOFMS色谱柱进行分析。PLD684基因的克隆链霉菌属NA684菌株的染色体DNA，根据Pospiech和Neuma