间接ELISA法测定抗人血清白蛋白效价

-1-间接ELISA法测定抗人血清白蛋白效价作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）【摘要】目的通过运用间接ELISA法，来测定抗人血清白蛋白的效价。方法用抗原、酪蛋白分别包被、封闭微孔板，再加入待检血清、一抗、二抗，建立间接包被模式酶联免疫法。经方阵滴定确定抗原和酶标抗体的最适浓度后，测定抗体效价。结果在包被的人ALB浓度为0.1ug/ml，二抗1：20000的稀释倍数时，测出的抗人ALB的效价范围为1：51200。结论运用间接ELISA法，在检测抗人ALB的灵敏度高，优化了反应条件，可用于初步抗人ALB的检测。【关键词】间接ELISA；抗人血清白蛋白；效价；羊抗人ALB、兔抗羊IgG-HRP间接ELISA法，是目前最常用的方法，因其灵敏度高，操作简便而被运用广泛。此方法是测定抗体最常用的方法，属于非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。此次试验就是用间接ELISA测定未知的抗人ALB的效价。1、主要试剂、仪器、材料及主要溶液的配制1.1主要试剂：人ALB标准品（250mg/支）；一抗(羊抗人ALB，效价1:701ml/瓶，批号：201106贮存于4～20℃，有效期：2年)；二抗(兔抗羊IgG-HRP，购自武汉博士德生物工程有限公司)；显色剂：A液、B液，ME002可溶性TMB显色液；终止液（2MH2SO4）；包被液：0.05MPH9.6碳酸盐缓冲液；洗涤液0.05%TWEEN-PBS；PBS缓冲液0.1MPH7.4；封闭液1%酪蛋白-PBST.1.2仪器：洗板机（BIO-RADMODEL1575）、孵箱（上海-恒科学仪器有限公司型号：DHP-9272）、SM-3自动化酶免疫分析仪（北京天石医疗用品制作所）1.3材料：96孔酶标板、一次性塑料试管、加样枪（上海求精生化试剂仪器有限公司）1.4主要溶液的配制：1)、0.05Mol/LPH9．6的碳酸盐缓冲液（包被稀释液）：准确称取1.6g碳酸钠，2.9g碳酸氢钠于烧杯中加水适量使溶解，用去离子水定溶于1L的容量瓶中，同时调节PH值至9.6；2)、PH7.4PBS缓冲液:准确称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水和磷酸氢二钠3.58g，磷酸二氢钾0.2g于烧杯中，用去离子水定溶于1L的容量瓶中，同时调节PH值至7.4；3)、封闭液1%酪蛋白-PBS-T：准确称取3g酪蛋白于以洁净烧杯中，再加入300mlPBS溶液和150ulTween20。将烧杯置于电炉上边搅拌边加热，直至酪蛋白完全溶解；4)、洗涤液0.05%TWEEN-PBS：向1000mlPH7.4PBS缓冲液中加入500μlTween20。PBS-T既是洗板液也是溶解封闭剂酪蛋白（1%）的溶解试剂，配方为PBS+Tween20.2、方法2.1微孔板制备：将96孔板划分为四个区域，每个区域4行6列。在1至4区的每微孔中分别加入100ul浓度为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml的包被抗原，用标签纸封板后，于4℃下过夜。取出微孔板于洗板机中洗涤3次，-2-拍干后，每孔加入300ul1%酪蛋白-PBS-T封闭液,，用标签纸封板后，4℃过夜。2.2标本及酶标二抗的加入：从冰箱中取出微孔板并于洗板机中洗涤3次，拍干后，向每一区域前5列微孔板中分别加入100μl浓度为1:100,1:400,1:1600，1:6400,1:12800的标本-羊抗人ALB，最后一列加入100μlPBS/孔，封板后于37摄氏度烘箱中孵育。1小时后取出微孔板，洗涤5次，拍干后向每一区域一至四行微孔板中分别加入100μl浓度1:1000,1:4000,1:16000，1:64000酶标抗体兔抗羊-HRP，37℃孵育30分钟。滴加一抗、二抗的布局如表1所示。表12.3显色及OD值的测定：取出微孔板洗涤5次，拍干后每孔加入各50μl显色液A,B液，于37摄氏度烘箱中孵育15至20分钟后向每孔加入100μl终止液。在SM-3自动化酶免疫分析仪上，于双波长450nm（参比波长630nm）处，测各孔OD值。2.4血清效价的测定：根据全班8个96孔板中筛选出包被抗原在0.01μg/ml和0.1μg/ml，二抗浓度在1：10000和1:20000的条件下，得出稍微有梯度的数据，然后根据以上数据设计如下确定实验。包被抗原浓度分别为0.1μg/ml、0.01μg/ml包被酶标板，封闭后，将待测血清按1：100、1:200、…、1:102400倍比稀释后分别加入到1至11号的各酶标孔中，最后第12孔加入PBS做空白对照，酶标二抗的加入浓度以1：10000，1：20000加入，（如表2所示），其他步骤同上2.1～2.3所述。羊抗人Alb血清羊抗人Alb血清兔抗羊-HRP1:1001:4001:16001:64001:12800PBS兔抗羊-HRP1:1001:4001:16001:64001:12800PBS1:10001:10001:4001:4001:16001:16001:640001:64000羊抗人Alb血清羊抗人Alb血清兔抗羊-HRP1:1001:4001:16001:64001:12800PBS兔抗羊-HRP1:1001:4001:16001:64001:12800PBS1:10001:10001:4001:4001:16001:16001:640001:64000人ALB:10μg/ml人ALB:1μg/ml人ALB:0.1μg/ml人ALB:0.01μg/ml-3-表23、结果3.1酶标抗体工作浓度的结果预实验检测人ALB的最适浓度和兔抗羊-HRP最适比例，测得的光密度（OD值）：表3实验结果显示：本次预实验中，4种不同包被抗原浓度组的结果均出现了不同程度跳跃，未出现正确的梯度变化，且背景太高，背景过高导致所有组均无法进行线性分析，所以预实验失败。根据全班8个96孔板中筛选出包被抗原在0.01μg/ml和0.1μg/ml，二抗浓度在1：10000和1:20000的条件下，得出稍微有梯度的数据。3.2待测血清效价的确定实验结果检测人ALB的最适浓度和兔抗羊IgG-HRP最适比例，测得的光密度（OD值）：一抗二抗1:1001:2001:4001：8001:16001:32001:64001:128001:256001:512001:102400PBS1:100001:200001:100001:20000123456789101112ABCDEFGH1.9632.2532.0002.1382.1951.8231.6091.8441.7911.9921.8671.3801.9251.7351.8512.0412.0911.7961.8351.9131.8431.6571.6441.5681.6191.8211.5961.3281.3771.1201.6931.5211.7441.0931.5150.9090.7860.6140.6100.5130.4270.0690.8201.0100.4300.3130.2540.6121.7651.5221.6581.7501.8711.7291.4261.6961.6402.0640.1381.5141.6761.9021.8061.7861.6750.7431.4811.3781.3141.4391.7821.3681.2991.5031.4971.3921.5411.3560.4331.2471.3531.2701.3490.6391.1051.6061.2841.3401.5240.4060.3930.5290.2720.1761.1191.390人ALB:0.1μg/ml人ALB:0.01uμg/ml-4-表4本次确定实验在包被抗原为0.1ug/ml，二抗浓度在1:20000的稀释倍数下时得到梯度的数据，实验成功。分析上述表格，可以在包被抗原为0.1ug/ml，二抗浓度在1:20000的稀释倍数下时，一抗与吸光度的线性关系最好，因此以包被抗原0.1μg/ml，二抗1：20000的稀释倍数为最佳工作浓度的情况下，标本兔抗人白蛋白效价的线性范围为1:100～1:51200，以一抗稀释倍数为横坐标，对应吸光度为纵坐标，做回归曲线：4、讨论本实验采用间接ELISA的方法测定抗人血清白蛋白效价，利用抗原抗体特异性结合，酶标二抗与一抗结合后通过酶标显色后用酶标仪测出OD值，再计算出空白值，根据样品的OD值与空白值的之比，若大于2.1则为阳性，若小于2.1则为阴性。这样即可确定工作浓度以及效价。在预实验当中，本小组并未得到很好的梯度来确定包被抗原与二抗的最适工作浓度，故在进行确定实验时是根据全一抗二抗1:1001:2001:4001：8001:16001:32001:64001:128001:256001:512001:102400PBSA1.2671.3311.3411.3821.0991.4010.7620.9850.7610.7360.2760.080B1.0140.8740.7950.7680.6040.5260.3830.3990.3360.1480.2810.086C1.6611.8861.3271.3701.1021.0731.3580.9601.4760.5261.7751.362D0.9830.8740.8381.0210.7500.6221.1450.0910.7600.5870.8500.573-5-班的实验结果来确定的工作浓度，由于在包被抗原为0.1μg/ml和0.01μg/ml，二抗稀释在1:16000时，有其它小组得出梯度数据，所以确定二抗的稀释为1:10000和1:20000。造成预实验结果出现跳跃，未出现适宜的梯度可能的原因有：（1）本次实验是有小组内成员分工合作，共同完成的，由于每个人操作方法都存在着差异性，这样势必会给最后的结果造成极大的误差；（2）实验中由于加量的孔众多，且均有一个人完成，容易造成每孔中的浓度与实验设计的浓度不一致，这样结果就不具真实性；（3）微孔板封闭后本应4℃过夜后即拿出进行洗板，但因为课程安排的问题，在封闭后第四天下午才进行洗板，取出酶标板部分孔底部有白色沉渣沉积，猜测可能因封闭时间太长，封闭液中已经出现微生物污染，从而影响最后的实验结果；（4）在加一抗和二抗时用手指放在反应板上，手上很多杂质比如蛋白质、汗液、细菌污染了反应板，继而影响了板底得抗原或者一抗二抗等物质；（5）加入终止液的速度太慢，导致各孔的显色时间不太统一，最终测出的OD值跳跃太大而没有规律。待测血清效价的确定实验通过测定各组合的OD值，分析结果得出当包被抗原为0.1μg/ml，二抗1：20000的稀释倍数时，一抗与吸光度的线性关系最好。5、结论通过间接ELISA法，我们确定了最佳抗原的工作浓度为0.1μg/ml，二抗稀释倍数1：20000，标本兔抗人白蛋白效价的线性范围为1:100～1:51200，回归方程为y=-0.1292lnx+1.5827，R=0.988。故抗人ALB的效价为1:51200。参考文献[1]吕世静.临床免疫学检验[M].第2版.北京：中国医药科技出版社，2010[2]曾常茜，陶志华.临床免疫学检验实验指导[M].第2版.北京：中国医药科技出版社，2010[3]王兰兰，许化溪.临床免疫学检验[M].第5版.北京：人民卫生出版社，2012[4]刘辉.临床免疫学检验实验指导[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2011[5]汪云利.简明临床检验实验学[M].第1版.西安：第四军医大学出版社，2007[6]李晓松.医学统计学[M].第2版.北京：高等教育出版社，2010