间接免疫荧光法实验操作常见问题(20110524)

间接免疫荧光法实验操作常见问题及解决方法EUROIMMUN间接免疫荧光法所遇问题的解决方法1.实验操作2.避免错误3.识别错误的来源EUROIMMUN准备稀释加样血清温育清洗间接免疫荧光法操作流程（1）1secflush1mincuvetteEUROIMMUN间接免疫荧光法操作流程（2）加荧光标记抗体温育清洗封片结果判断1secflush1mincuvetteEUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免(1)•清洁工作台•用通常的家用洗涤剂和蒸馏水清洗加样板的反应区，用纸巾吸干。•在作某些特殊检测时需要使用消毒液清洗加样板。•只有当生物薄片载片平衡到室温后方可打开包装。•可用防水的黑色标记笔在生物薄片载片的正面作标记。•只能在手可触摸的区域作标记。•不要触摸生物薄片。实验准备阶段：EUROIMMUN间接免疫荧光法工作台的布置EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免(2)样本稀释阶段：•在稀释前用旋涡混匀器混匀标本。•用可靠的去离子水配置PBS-吐温缓冲液。•确保已稀释标本的量足够用于所计划的所有实验。•用PBS-吐温缓冲液稀释病人标本。EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免(3)•应把窗户关上，以避免已稀释样本的蒸发。•因塑料制品会吸附抗体，造成抗体浓度的下降，所以最好用玻璃管稀释样本。•将样本滴加在加样板的反应区。•加样量要准确。•避免产生气泡。•加完所有样本后方可开始温育。滴加样本至加样板的反应区：EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免(4)•确保液滴与生物薄片接触良好。•避免样本之间相互接触。•避免快速移动加样板。•确保生物薄片与加样板的反应区吻合良好。•避免缩短或延长温育时间。血清温育阶段：EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法(5)•用PBS-吐温缓冲液流水迅速冲洗载片(用大口杯，不要用细颈瓶)。•流水冲洗载片后立即放进盛有PBS-吐温缓冲液的小杯中浸洗。清洗：EUROIMMUN清洗EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法(6)•荧光二抗直接使用•不要将结合物放在阳光直射处。荧光素标记的二抗（结合物）的使用：EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免(7)•从小杯中垂直取出载片。•用事先叠好的纸巾从背面擦拭载片。•不要擦拭反应区之间的间隙。•5秒钟内进行第二次温育。•从现在开始，避免阳光直射载片，直至实验结束。载片在第一次清洗后的处理：EUROIMMUN载片的擦拭EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免(8)•可用聚苯乙烯封片板。•盖玻片上每反应区滴加PBS-甘油8ul，不要超过10ul。•用纸巾擦拭载片的背面和四周，不要擦拭反应区间隙。•将载片有生物薄片的一面朝下，盖在已准备好的盖玻片上，将盖玻片粘起来。•立即检查盖玻片与载片是否吻合良好，必要时可调整盖玻片的位置。封片：EUROIMMUN封片EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免(9)•将荧光显微镜放置在光线比较暗的房间。•使用合适的目镜和滤光片。判断组织用的目镜有：20x，dry,Apertur0,6e.g.Planapochromat,PlanNeofluar(Zeiss),HCPLFluotar(Leica)objectivesforevaluationofcells:40x,dry,Apertur0,7e.g.PlanNeofluar(Zeiss),HCXPLFluotar(Leica)filters:e.g.Excitingfilter450-490nm,SuppressionfilterLong-Pass520nm•确保光线合适。•如果模板片中ANA的荧光模型不能达到预期的强度，应更换灯泡。结果判断：EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的来源(1)当出现问题时，我们应该检查：•组织切片完整与否。•基质是否有缺损。•组织形态是否完整。•....EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的来源(2)当出现问题时，我们应该：•重做实验，以排除实验操作中的错误。EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的来源(1)当出现问题时，我们应该检查是否有：•图像不清•气泡•荧光强度减弱•组织有非特异反应•组织根本不反应EUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的来源(2)EUROIMMUN镜下图像不清主要的原因：封片基质过量。盖玻片与载片吻合不好。目镜的镜头模糊不清。使用了两张盖玻片。盖玻片表面模糊不清。盖玻片表面有水滴。显微镜有问题。间接免疫荧光法问题的解决方法辨别错误的来源(3)EUROIMMUN气泡：•封片不正确。•除去封片基质中的气体。EUROIMMUN荧光强度减弱：主要的原因：显微镜调整的不合适。本来应直接使用的血清又作了进一步的稀释。荧光素标记的二抗暴露在阳光直射处。温育后的载片暴露在阳光直射处。间接免疫荧光法问题的解决方法辨别错误的来源(4)间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的来源(5)组织有非特异性反应主要的原因：在显微镜镜检过程中生物薄片区域被淬灭。温育过程中有气泡产生。温育过程中有液体蒸发。有肉眼可见的FITC结晶。EUROIMMUN显微镜镜检过程中生物薄片被淬灭EUROIMMUN温育过程中有气泡EUROIMMUN温育过程中有液体蒸发EUROIMMUNEUROIMMUN间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的来源(6)按传统的方法温育:有肉眼可见的FITC结晶。用滴定平板技术温育：没有FITC结晶。间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的来源(7)组织切片没有任何反应主要的原因：在温育过程中有血清或二抗的丢失。缓冲液质量不好。EUROIMMUNEUROIMMUN由刮或擦拭所引起的基质损坏由于挤压所引起的基质损坏EUROIMMUN由于掀盖玻片所引起的基质损坏EUROIMMUN灰尘颗粒EUROIMMUN组织折叠EUROIMMUNEUROIMMUN没有进行血清温育EUROIMMUN没有进行二抗温育载片过度干燥(1)(血清温育后5分钟Hep-2细胞)对照过度干燥EUROIMMUN参照过度干燥载片过度干燥(2)(血清温育后5分钟猴肝)EUROIMMUNTrocknungnachKonjugatschrittBIOCHIPMitte(20er)参照载片过度干燥(3)(酶结合物温育后5分钟)过度干燥EUROIMMUN载片保存不当(温度或湿度过高)参照温度或湿度过高EUROIMMUN使用自来水配置PBS-吐温缓冲液正常操作使用自来水配置PBS-吐温缓冲液：细胞不清晰，背景不干净使用蒸馏水清洗浸泡载片正常操作使用蒸馏水清洗浸泡载片：细胞肿胀变形，滴度下降PBS-吐温缓冲液常温（25℃）放置1周正常操作PBS吐温缓冲液常温放置1周：背景不干净缓冲液配置只使用PBS正常操作缓冲液配置只使用PBS：背景不干净，1：100滴度结果变阴性清洗时只冲洗不浸泡正常操作清洗时只冲洗不浸泡：结果转阴，可能出现Hep-2阴性，肝片阳性结果酶结合物1：10稀释正常操作酶结合物1：10稀释：中滴度结果转阴二抗加样量过多正常操作二抗加样30ul：荧光有增强二抗加样量少正常操作二抗加样量为15ul：荧光减弱37℃温育正常操作37℃温育：反应性增强，滴度升高