重组乙酰化胸腺素项目计划书

项目计划书重组乙酰化胸腺素4治疗干眼症、心肝肾损伤等的研究进展2013年10月31日项目计划书1、Tβ4的结构及功能1.1Tβ4的结构β胸腺肽包括一类结构相关，氨基酸序列高度保守的蛋白。在已知的16种β胸腺肽中，存在于人体内的主要有三种，胸腺肽β4(Tβ4)，胸腺肽β10(Tβ10)和胸腺肽β15(Tβ15)。尽管他们在结构上十分相似(43-44个氨基酸残基)，但是这三种酸性多肽均来自不同的基因产物，因此各自具有其独特的生化和生理功能。Tβ4最初分离自小牛胸腺组织，是一个只含有43个氨基酸残基的小分子多肽，N末端Ser被乙酰化。Tβ4的一级结构如下：Ac-SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGESTβ4的构象高度可变，核磁共振研究表明当其存在于水溶液中时，除了极少数α螺旋结构，大部分以无结构形式存在。此外，圆二色谱也证明了在温度5-40℃，pH值4.5-7.5的水溶液中，Tβ4也没有二级结构形成。然而，当Tβ4中央17LKKTETQ23保守区与肌动蛋白单体(actin)发生反应后，便会诱导Tβ4形成N端和C端螺旋结构。Tβ4与肌动蛋白单体反应生成1：1的复合体，正是通过这一反应，Tβ4富集了大量肌动蛋白单体，从而可以调控体内肌动蛋白纤维丝的聚合和解聚。因此Tβ4影响细胞分化，细胞形态，细胞迁移和器官发生与其维持G-肌动蛋白和F-肌动蛋白之间的动态平衡密切相关。1.2Tβ4的功能Tβ4在β胸腺肽中存在范围最广，含量最高，在各种细胞和组织中其含量高达0.3-0.4mM，在胸腺组分中占到70-80%。由于Tβ4分布广泛且含量高，因此它具有许多重要的生理功能(图1)。图1.Tβ4的生物学功能1.2.1Tβ4促进细胞迁移和黏附在所有都真核生物中Tβ4是最主要的肌动蛋白分离蛋白，在哺乳动物中为潜在的肌动项目计划书蛋白聚合调节因子。肌动蛋白参与众多的细胞功能，包括细胞迁移、细胞黏附、细胞分化、胞质分裂、泡囊和细胞器官运动、微管构建和维护细胞功能和形态等。调节肌动蛋白的聚合和解聚是Tβ4促进细胞迁移的主要原因。Tβ4还可以从基因水平通过上调层粘蛋白5的表达来影响细胞迁移。层粘蛋白5不仅是位于皮肤、角膜、结膜和其它组织基底膜中锚丝纤维的重要成分，还是一种独特的位于上皮下基底膜中的蛋白，是角质化细胞迁移和黏附的最佳受体。此外Tβ4还可以通过与PINCH和ILK形成一种功能性复合物来激活Akt，Akt不仅能促进细胞生长和生存，还能促进细胞迁移。1.2.2Tβ4促进血管发生和分化Tβ4通过促进上皮细胞分化和定向迁移以及血管形成来刺激血管发生。通常认为中央17LKKTETQ23肌动蛋白结合区具有这一功能。此外，内蛋白酶切割Tβ4N末端产生的四肽Ac-SDKP也能刺激内皮细胞迁移和分化，表明Ac-SDKP和Tβ4都具有促进血管发生的作用。在将Tβ4基因敲除的小鼠心脏模型中给药Tβ4，发现其不仅能在胚胎发育时期促进冠状血管的发生和分化，还能通过刺激原初的心外膜血管使心外膜分化成为平滑肌和内皮细胞。在多种啮齿动物模型，Tβ4能促进干细胞迁移和分化成为基底细胞，还能促进毛囊膨胀[20]，这两种功能分别与皮肤修复和头发生长相关。1.2.3Tβ4阻止细胞凋亡，促进细胞存活和组织再生经研究，体外实验中Tβ4能通过降低线粒体损伤和减少线粒体释放细胞色素C，增加bcl-2的表达以及抑制半胱天冬酶的激活来消除乙醇对角膜上皮细胞毒性。Tβ4能抑制内皮细胞凋亡，激活心肌炎症组织中磷酸肌醇/Akt细胞生存信号途径。Tβ4能抑制心肌梗死组织中内皮细胞的死亡从而促进心肌再生，诱导血管生成。1.2.4Tβ4减轻炎症，抑制炎症细胞的扩散和黏附在真皮、眼角膜、心肌损伤和内毒素诱导的败血症模型中，Tβ4可下调炎症介质，减少炎性细胞浸润。这些活性与Tβ4能降低MMPs产生，抑制核转录因子NFkB的激活和易位有关。此外，IL-10具有降低免疫反应的特性，如抑制单核细胞中促炎症反应细胞活素和MHCII的表达，而Tβ4能下调IL-10，从而提高免疫反应，减轻炎症。2、Tβ4的临床应用研究进展研究证明Tβ4拥有广泛的生物活性和生理功能，国外雷根内克斯公司对其作为治疗用药的研究已经进入了II期临床阶段。在I期临床研究中，设置4个剂量组（分别是42mg、140mg、420mg和1260mg），静脉注射，单次及多次给药（每天1次，持续14天），证明其具有良好的耐受性，而且非常安全。试验期间未观察到与其相关的不良反应，后期6个月的随访中也没有观察到不良症状。目前对Tβ4的临床研究主要分为以下几个方面：治愈和修复皮肤疮伤如压迫性溃疡、静脉停滞淤积性溃疡；干眼症；角膜穿孔；肺纤维化；心肌损伤；肝纤维化；肾纤维化等。2.1干眼症治疗研究进展目前正在进行II期临床研究。在动物实验中，应用Tβ4治疗干眼症的疗效好于现有药物环孢菌素A和强力霉素，有望成为新一代的干眼症治疗药物。项目计划书此外，在一些临床研究中也显示，Tβ4对一些难以愈合的角膜溃疡和角膜穿孔也有疗效。干眼症,又称角结膜干燥症，是指各种原因引起的泪液质和量或动力学的异常,常导致泪膜不稳定和眼表面组织病变，并伴有眼部不适症状为特征的一类疾病的总称。据调查，干眼症的发病率为28.7%，其中女性发病率33%，男性发病率22%，严重干眼症16%。现有的治疗干眼症的方法主要是人工泪液替代疗法，但只能缓解病情。干眼症治疗药物现已成为药物研究热点之一，市场潜力有几百亿元。2.2心肌损伤治疗目前国外正在开展Tβ4治疗急性心肌梗塞后心脏修复的II期临床研究。前期研究表明Tβ4有助于预防和修复缺血性心脏病发作后的心脏损伤，预防心肌细胞凋亡，刺激成体心外膜干细胞分化成新的心脏血管。急性心肌梗塞是冠心病发展到严重阶段的一种类型，目前发病率较高，是一种严重危害人民健康的心血管急症。它是在冠状动脉病变的基础上，发生冠状动脉供血急剧减少导致相应的心肌严重而持久的缺血。80%急性心肌梗塞是由于梗塞的冠状动脉血管在原有狭窄的基础上，突然发生血栓，导致血管阻塞，是由心理、社会和生物等多种因素引起的心身疾病，已成为我国三大死亡疾病之一。2.3肝脏纤维化治疗肝纤维化的发病率逐年增加，肝纤维化的不断进展最终将发展为肝衰竭。一些研究表明Tβ4可用于治疗肝脏纤维化。Tβ4能够抑制蛋白激酶AKT的活化，进而抑制PDGF-β受体的表达。此外，Tβ4能够上调肝细胞生长因子HGF的表达，促进肝细胞再生，抑制TGF-β和胶原的产生，缓解肝脏纤维化过程。2.4肾脏纤维化治疗最新文献（ZouY,ChunB,PotthoffSA,etal.Thymosin4anditsdegradationproduct,Ac-SDKP,arenovelreparativefactorsinrenalfibrosis.KidneyInternational,5June2013）报道，Tβ4可用于治疗肾脏纤维化。3、Tβ4的制备研究进展从1979年开始，BerhardL.Horecker’s教授的团队开发出了多种方案用于从组织和细胞中纯化β胸腺肽的各种组分。目前主要采用化学合成的Tβ4进行生物学和临床研究。由于化学合成成本高，合成试剂毒性大，所以人们尝试用生物合成方法制备Tβ4。目前国内外几个课题组利用大肠杆菌表达系统制备得到的Tβ4或者为二串联体，或者一端带有亲和标签，或者由于与其它融合伴侣表达，但切割后留下了残余氨基酸的Tβ4。Tβ4作为一种潜在的临床治疗用药，当其序列中有多余氨基酸残基时，可能会引发机体免疫反应或者改变药物代谢动力学。此外，普通生物合成技术难以实现Tβ4的乙酰化修饰。本项目解决了生物合成乙酰化胸腺素的两大难题。项目计划书3.1利用优化Intein融合表达技术高效合成小分子多肽我们应用一种特殊Intein（蛋白质内含肽）介导的切割技术，建立了小分子多肽的融合表达及切割技术平台。借助该平台，成功地实现了胸腺素的高效生物合成。其技术如右图所示。图2利用Intein介导切割技术制备多肽3.2与N-末端乙酰转移酶共表达实现体内胸腺素的乙酰化修饰多肽的N-末端乙酰化修饰是由N-末端乙酰转移酶（NAT）将乙酰辅酶A的乙酰基团（CH3CO-，分子量43.018Da）转移到蛋白质氨基末端的α-氨基上。细胞内多肽要获得乙酰化修饰至少需要两种条件，一是适当的N-末端序列，二是要有合适的NAT活性存在，因为每一种NAT都有特定的底物群体。为了实现胸腺素的N-末端乙酰化修饰，我们利用基因敲除筛选技术及基因补救方法，找到了可以修饰Tα1和Tβ4的NAT。将NAT与胸腺素融合蛋白共表达可以使胸腺素得到充分乙酰化修饰。3.3技术集成图3高效生物合成胸腺素如上图所示，本项目应用Red重组技术将特异的NAT整合到大肠杆菌染色体上，获得稳项目计划书定表达NAT的宿主，然后将构建的高表达Intein融合蛋白质粒转入其中，得到高表达工程菌。应用高密度培养技术，经过纯化、切割、精细纯化，每升培养液可以获得纯度98%的重组N-末端乙酰化胸腺素200mg，达到国际领先水平。已申请中国发明专利2项（一种制备N-末端乙酰化的胸腺素α1的方法及其专用工程菌。申请日：2009年2月16日。专利号：ZL200910077750.8。重组N-末端乙酰化蛋白或多肽的制备方法及其专用工程菌。专利号：ZL201010521842.3；授权日2012年5月4日）。3.4与化学合成方法比较3.4.1成本降低本课题采用合成生物学技术，改造大肠杆菌使其能够充分对Tα1进行乙酰化修饰，从而直接表达获得完全乙酰化修饰的Tα1。该技术已申请中国专利（申请号：200910077750.8；公开号CN101497863A）。应用我们的生产工艺，从每升发酵液中可以提取200mg纯品（纯度大于98%），其结构与化学合成的Tα1完全一致，成本不到2元/mg，而化学合成的成本在3元/mg以上，直接降低生产成本50%。因此，本课题所实施的技术具有低成本优势。3.4.2环境污染减少本技术还具有环保优势。采用生物合成方法可以避免化学合成中需要使用的大量有毒化学试剂，特别是体外乙酰化修饰需要应用管控化学品乙酸酐。3.4.3生产规模更容易放大生物合成方法采用微生物培养技术，很容易放大。超大规模（几百吨）微生物培养技术在国际、国内都非常成熟，并在抗生素、氨基酸、有机酸等生产领域广泛应用。而多肽的化学合成规模放大有一定的限制。四、合作研究方式本项目因经费问题目前进展缓慢，希望有资金及人员投入，共同推进。此外，该工艺也可以用于生物合成胸腺素1，即日达仙（癌症辅助治疗，提高老年人免疫力），成本为每毫克2元。联系方式：[e-mail],13683058872