金属离子对柔红霉素与人血清白蛋白相互作用的影响

1金属离子对柔红霉素与人血清白蛋白相互作用的影响华南农业大学理学院06应用化学陈伟锐3863487713760882069华南农业大学理学院06应用化学林谋宏3863487713760878919华南农业大学理学院06应用化学谢哲铭3863487713760879132摘要柔红霉素是蒽环类抗生素，是治疗急性白血病的首选药，也用于治疗各种癌症。本实验采用平衡透析法，结合紫外可见光分光光谱法研究柔红霉素与人血清白蛋白（HSA）的相互作用。根据Langmuir等温吸附方程，得到柔红霉素与HSA的结合常数。在此基础上，考虑不同金属离子的作用下，柔红霉素与HSA结合的变化，通过数学模型研究金属离子对药物与蛋白作用过程中的影响。本实验在综合文献方法和结合实验条件的基础上,对药物小分子与人血清白蛋白相互作用进行探讨，并对生理条件下金属离子与药物作用机理进行研究，能够对药物生产起到一定的作用。关键词柔红霉素人血清白蛋白平衡透析可见光吸收1前言研究药物分子与蛋白质的作用，对理解蛋白质结构与功能的关系以及阐明药物动力学、耐药性和毒副作用的机理有着重要的意义。随着科学的进步和技术方法的发展，这方面的研究内容也在不断深入。蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸残基都具有特殊的光学活性。许多药物分子本身也具有光学活性，或与蛋白质分子结合后产生光学活性，因此用光谱方法通过蛋白质分子结合药物分子后结构的变化研究结合机理，是有效和广泛的方法。紫外-可见光谱法也是研究药物与生物分子相互作用机理最常用、最方便的方法，因为有效药物与生物分子结合后，它们的吸收光谱会有一定的改变，出现吸收峰位移或谱峰宽度变化，由此可研究生物分子与药物间的结合强弱及结合机理。柔红霉素（DNR，结构如图1所示）作为一种重要的蒽环类抗肿瘤抗生素，是目前治疗急性淋巴细胞性白血病和急性粒细胞性白血病的首选药，但长期使用这类药物使心肌肌原纤维失去肌球蛋白，引起不可逆的心力衰竭，限制了它在化疗中的广泛应用。因此，有关DNR心脏毒性的基础与临床研究成为重要的课题。对柔红霉素与血清白蛋白的2反应和测定进行研究具有非常重要的现实意义。本实验采用平衡透析法，以紫外可见光分光光谱法研究柔红霉素与人血清白蛋白（HSA）的相互作用。根据Langmuir等温吸附方程，得到柔红霉素与HSA的结合常数。同时，考虑不同金属离子的作用下，柔红霉素与HSA结合的变化，通过数学模型研究金属离子对药物与蛋白作用过程中的影响。以此来研究柔红霉素与HSA的反应及其作用规律，为了解柔红霉素的人体作用机理和药物生产改进提供了实验依据。2实验目的(1)探究平衡透析与紫外分光法相结合研究药物小分子与HAS相互作用的方法；(2)综合文献方法，进一步研究不同数学模型对实验数据的处理方法；(3)研究柔红霉素与HSA的相互作用，探讨不同金属离子的存在对其药效的影响，为了解其作用机理并改进生产工艺提供实验依据。3实验原理3.1平衡透析法的实验原理平衡透析法是利用与血浆蛋白结合的药物不能透过半透膜的特性进行测定的。此方法是将血清白蛋白置于透析袋内，将透析袋置于装有缓冲液的容器中。本实验采用的透析袋容许分子量小于14000的物质透过，可以让系统中游离的药物自然透过，而不能让蛋白质等大分子物质透过。实验中采用离心管作为透析的容器，将透析袋置于离心管中。当达到平衡后，透析袋内外游离型药物浓度相等，而透析袋内除含有游离型药物外，还保留了药物与蛋白质的结合物(即结合型药物)。若已知体系中药物总量，并且用适当的分析方法测定透析袋内药物总浓度和透析袋外游离型药物浓度，则可以通过透析袋内药物总浓度与透析袋外游离型药物浓度之差，计算药物与血浆蛋白的结合率。AcOMeMeOHOOOHOHOONH2OHHSSRSSS图13%cc-c100结合率血浆212蛋白(1)式中，1c为透析袋外游离型药物浓度，2c为透析袋内药物总浓度。1c和2c可以由相应的吸光度通过6.1节建立的吸光度-浓度标准曲线求得。3.2柔红霉素含量的测定根据柔红霉素的紫外-可见光扫描图可知，柔红霉素的最大吸收波长在(233±1)nm，(254±1)nm和(499±1)nm，本实验中柔红霉素的含量测定方法选择可见分光光度法，测定波长为499nm。3.3根据Langmuir等温吸附方程求结合常数在透析袋内HSA浓度一定时，根据Langmuir等温吸附方程，即KcKc1(2)其中是结合率，K是结合常数，c是柔红霉素的本体浓度。并且maxc(3)其中，c是浓度不同时的柔红霉素与HSA的结合量，12cc-c，max是在实验条件下即HSA浓度一定时柔红霉素与HSA的最大结合量。因此，联合方程(2)和(3)可以得到KcKcα1maxc(4)进一步变形可以得到Kcααmaxmaxc111(5)以c1对c1作图并进行拟合，可以计算得到结合常数K。3.4金属离子的影响HSA与柔红霉素的结合常数，也可以通过HSA与柔红霉素发生相互作用前后的吸光度值与柔红霉素浓度之间的关系求出。cAKAAAA000111(5)其中0A和A分别为HSA与柔红霉素发生相互作用前后的吸光度值，c为柔红霉素的本体浓度，AK为HSA与柔红霉素之间的结合常数。4以AA01对c1作Lineweaver-Burk双倒数曲线图，通过斜率和0A可以求得AK。正常的生理条件下，体内Ca2+浓度为2.0×10-3mol/L，Mg2+浓度为1.2×10-3mol/L。本实验模拟正常生理条件下Ca2+、Mg2+单独存在以及两者同时存在下，对DNR与HSA相互作用的影响。将金属离子与HSA培育一段时间后，再加入柔红霉素，记录吸光度变化。探讨金属离子对药物与蛋白相互作用的影响。4实验设备电子分析天平，电热恒温水浴锅，紫外可见吸收光谱仪离心管，吸量管，容量瓶，吸耳球，烧杯，玻璃棒，铁架台5实验材料及试剂柔红霉素(DNR，纯品原料粉末，深圳制药厂，自备)人血清蛋白(HSA，分子量66478，Sigma公司，自备)磷酸缓冲溶液(PBS,pH=7.4，10mL，自备)CaCl2溶液(0.1mol·L-1，1mL，自备)MgCl2溶液(0.1mol·L-1，1mL，自备)透析袋(14000Da，购自上海生工，自备)所有试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。a.试剂的配制磷酸缓冲溶液(PBS,pH=7.4)：由1/15mol·L-1磷酸二氢钾、1/15mol·L-1磷酸氢二钠以及0.1mol·L-1氯化钾溶液按一定比例配制于250mL容量瓶中；HSA溶液(200µmol·L-1)：准确称取HSA粉末0.0133g，以PBS为溶剂，于1mL离心管中配制。CaCl2溶液(0.1mol·L-1)：称取0.0111g无水CaCl2，于1mL离心管中，用蒸馏水溶解。MgCl2溶液(0.1mol·L-1)：称取0.0095gMgCl2，于1mL离心管中，用蒸馏水溶解。b.材料的处理透析袋使用前在二次蒸馏水中浸泡过夜6实验操作步骤56.1绘制标准曲线称取柔红霉素标准品0.0053g于1mL离心管中，以PBS溶液为溶剂溶解定容1mL，得到浓度为1.0×10-2mol/L柔红霉素溶液，并依次稀释，得到浓度分别为5.0×10-3mol/L、1.0×10-3mol·L-1、5.0×10-4mol·L-1、1.0×10-4mol·L-1的标准溶液。并以2mLPBS缓冲溶液为空白对照，在499nm处测定其紫外可见吸光度。以吸光度值为纵坐标，柔红霉素浓度为横坐标绘制标准曲线。6.2柔红霉素与HSA相互作用的研究向5个透析袋中均加入30µL的200µmol·L-1HSA，然后分别加入15、20、30、50、60µL1.0×10-2mol·L-1柔红霉素溶液后封闭。再把透析袋放入2mLPBS缓冲溶液的离心管中，使之完全浸没。在37℃的水浴中恒温培养2h，取出，移取100µL透析袋外面溶液于1mLPBS中测定其紫外可见吸光度，绘制紫外可见吸收曲线。6.3Ca2+Mg2+对柔红霉素与HSA相互作用的影响向三个5mL离心管中均加入2mLPBS缓冲溶液，100µL200µmol·L-1HSA溶液，标记管号，1号管加入0.045mL0.1mol·L-1CaCl2溶液，2号管加入0.027mL0.1mol·L-1MgCl2溶液，3号管同时加入两种溶液，在37℃的水浴中恒温培养30min，测定吸光度，再分别加入100µL1.0×10-2mol·L-1柔红霉素溶液，在37℃的水浴中恒温培养1.5h。再次测定吸光度。将柔红霉素溶液的浓度换成同体积5.0×10-3mol/L、1.0×10-3mol·L-1、5.0×10-4mol·L-1、1.0×10-4mol·L-1的溶液，重复以上步骤。7结果及计算7.1表一柔红霉素浓度与吸光度关系柔红霉素浓度(mol·L-1)499nm处吸光度ΔA(nm)空白01.0×10-25.0×10-31.0×10-35.0×10-41.0×10-46以吸光度值为纵坐标，柔红霉素浓度为横坐标绘制标准曲线。7.2表二柔红霉素浓度与结合度的关系柔红霉素透析袋外透析袋内结合量12cc-c(mol·L-1)体积(µL)浓度(mol·L-1)吸光度1ΔA(nm)浓度1c(mol·L-1)吸光度2ΔA(nm)浓度2c(mol·L-1)空白------1520305060以c1对c1作图并进行拟合，计算结合常数K。7.3表三Ca2+Mg2+对柔红霉素与HSA相互作用的影响DNR浓度c(mol·L-1)管号恒温30min后吸光度0ΔA(nm)恒温2h后吸光度ΔA(nm)ΔAΔA0(nm)71.0×10-21235.0×10-31231.0×10-31235.0×10-41231.0×10-4123以ΔAΔA01对c1作图，通过斜率和0ΔA计算HSA与柔红霉素之间的结合常数。8注意事项[1]为防止污染，透析袋须戴手套取用，使用前要在二次水中浸泡5min；[2]平衡透析法透析时间长短和温度与药物的扩散速度有关。应当在正式实验前进行预试验来确定，以保证平衡时间足够(即袋内外浓度不再随时间而改变)。[3]在平衡透析法中，药物有可能与膜发生结合。药物与膜结合程度取决于药物的性质，当结合程度高时，会对试验结果产生干扰。所以在进行光谱分析时，应设立空白对照组。9费用预算人血清白蛋白(HSA)0.02g(自备)10元柔红霉素标准品0.01g(自备)5元透析袋(购自上海生工)10个(自备)10元8其它试剂5元总计30元参考文献[1]Chong-QiuJiang,Ming-XiaGao,Xian-ZheMeng,Studyoftheinteractionbetweendaunorubicinandhumanserumalbumin,andthedeterminationofdaunorubicininbloodserumsamples,SpectrochimicaActa,2003,PartA59:1605-1610[2]FenglingCui,LixiaQin,GuishengZhang,XiaojunYao,BeileiLei,Studyoftheinteractionofaglyconofdaunorubicinwithhumanserumalbuminbyspectroscopyandmodeling,MicormolecularBioscience,2008,8:1079-1089[3]叶志钧,刘英菊,朱丽.平衡透析法研究小檗碱与人血清白蛋白的相互作用[J],广东化工,2009年第1期,第36卷:73-76[4]黄锐,夏之宁,.龚萍.血清白蛋白与小分子化合物相互作用的荧光光谱研究,光谱学与光谱分析,2008年1月,第28卷第1期:161-164[5]刘阳,孙小梅,李步海,.林爱华.Ca2+Mg2+对柔红霉素结合心肌肌球蛋白影响的荧光法研究,微量元素与健康研究,2008年5月,第25卷第3期:10-12[6]高明霞.荧光光度法研究药物与生物大分子的相互作