食品大分子的分离纯化和结构研究

食品大分子的分离、纯化和结构研究淀粉的分离和纯化淀粉的制备直链淀粉与支链淀粉的分离直链淀粉在溶液状态下分子伸展，很容易与一些极性有机化合物如正丁醇、百里酚、异戊醇等通过氢键缔合，形成结晶性化合物而沉淀。支链淀粉在溶液中呈分枝状，当溶液中有极性有机化合物存在时，由于有较大的空间位阻，不易形成复合物沉淀。因此，利用这种性质可以将支链淀粉和直链淀粉分开直链淀粉的纯化：重结晶方法支链淀粉的纯化：重结晶方法淀粉凝胶过滤色谱：如Sephrose2B凝胶柱纯化的支链淀粉和直链淀粉碘复合物吸收光谱测定加入0.5mL碘试剂（含2%碘化钾，0.2%碘），紫外可见分光光度计于波长400－800nm对样品进行吸收光谱测定直链淀粉与碘生成的蓝色吸收峰在620－680nm左右，支链淀粉与碘生成紫红-红色，其吸收峰随不同来源而有差异碘亲和力测定根据直链淀粉和支链淀粉对碘吸附能力大小的不同，从而引起电学性质(电流、电压)的变化进行测定的用Schoch方法测定各种淀粉中直链淀粉的碘亲和力，玉米为19.0%，小麦为19.9%，马铃薯的为19.9%，木薯的是18.6%，支链淀粉的碘亲和力大多数情况下为0.5～1%以下蓝值表示淀粉与碘结合性能的一个指标。它一般通过测定淀粉与碘所形成的络合物在一定波长下的光吸收值，然后计算而得一般直链淀粉的蓝值为0.8～1.2，支链淀粉0.08～0.22A链：以还原性末端通过α-1,6糖苷键结合到另一条链上而自己不被结合的链B链：结合到别的链上，同时又被别的链结合的链C链：具有一个还原性末端的链外链（exteriorchainlength，ECL）：非还原性末端至最靠近外侧分支点的一段链内链（interiorchainlength，ICL）：相邻两个以α-1,6糖苷键为分支点的一段链支链淀粉的分子结构参数支链淀粉的分支结构β-极限糊精的制备β-淀粉酶作用于支链淀粉时，从α-1,4糖苷键的非还原末端依次切下麦芽糖单位，同时使麦芽糖由α-型转变成β-型麦芽糖。当反应至α-1,6糖苷键附近时，停止反应，此时形成β-极限糊精支链淀粉平均链长CL的测定取纯化的支链淀粉分散于醋酸缓冲液中，加入普鲁兰酶。在反应过程中，不断检测反应体系的还原力（以葡萄糖计），当还原力达到一恒定值时，灭酶，冷却，得到支链淀粉普鲁兰酶的脱支水解产物。测定体系中的总糖和总还原力，计算支链淀粉的平均链长CL（为每一非还原末端基的链所具有的葡萄糖残基数）：CL=产物中的总糖（葡萄糖当量）/产物中的总还原力（葡萄糖当量）取纯化的支链淀粉分散于醋酸缓冲液中，加入β-淀粉酶。在反应过程中，不断检测反应体系的还原力（以葡萄糖计），当还原力达到一恒定值时，灭酶，冷却，测定体系中的总糖和总还原力，计算支链淀粉的β-淀粉酶的水解率：β-淀粉酶的水解率=还原力（麦芽糖当量）×100/总糖（麦芽糖当量）支链淀粉β-淀粉酶的水解率ECL=CL×β-淀粉酶的水解率＋2ICL=CL―ECL―1支链淀粉的外链和内链的链长支链淀粉的分支化度测定取β-极限糊精分散于醋酸缓冲液中，沸水加热5min，然后冷却，制成β-极限糊精溶液。以此为底物，采用异淀粉酶和普鲁兰酶水解，测定支链淀粉的分支化度分支化度=A/B+1异淀粉酶和鲁兰酶和都能催化水解α-1,6糖苷键，但二者作用的最小单位不同。异淀粉酶所切断的α-1,6糖苷键，当分支点的葡糖基在少于三个时就不能作用，而普鲁兰酶只要分支点葡糖基在二个以上就可以切断α-1,6糖苷键异淀粉酶作用后体系的还原力反映的是B链的总数和半数的A链：（0.5A＋B）普鲁兰酶作用后得到的还原能力为A链数与B链数的总和：A＋B多糖的分离、纯化、结构分析及构效关系红枣洗净去核→平均分成9份(每份50g)粉碎打浆→热水浸提→将浸提液过滤→热水浸提→过滤合并两次滤液→冷冻浓缩→加无水乙醇沉淀→4℃静置2h后离心(4000r/min，10min)→沉淀→过滤→石油醚脱脂→冷冻浓缩→粗多糖→三氯乙酸法去蛋白→活性炭脱色过滤→多糖样品多糖的提取离子交换柱层析凝胶柱层析等分离、纯化方法结构分析对多糖结构研究常采用的方法有分子量测定、单糖组成、高碘酸氧化和Smith降解、甲基化分析以及物理分析方法等多糖的结构分类沿用了蛋白质和核酸的分类方法，也可分为一级、二级、三级和四级。多糖的一级结构是指多糖的单糖残基的组成、排列顺序、相邻单糖残基的连接方式、异头物的构型及糖链有无分支、分支的位置和长短等；二级结构指多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体，关系到多糖分子中主链的构象，不涉及侧链的空间排布三级结构是指多糖链一级结构的重复顺序，由于糖残基中的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非共价相互作用，导致有序的二级结构空间形成有规则而粗大的构象；四级结构是指多糖链间非共价键结合形成的聚集体，其中二、三、四级结构统称多糖的高级结构，其与多糖的活性关系更加密切分子量测定多糖的性质往往与它的分子量的大小有关。在测定分子量时，为了避免因存在杂质而影响测定结果，需把待测样品适当纯化常采用的测定分子量的方法有①高效液相色谱法。②粘度法。所需设备简单，操作较易于掌握，先测定样品特性粘度，然后通过换算方程计算分子量。③光散射法。单糖组成一般将多糖在三氟乙酸作用下水解，检测水解产物中的单糖组分常采用的检测方法有纸层析(PC)、薄层层析(TLC)和气相色谱(GC)等经典的PC和TLC不够灵敏，气相色谱法和现代毛细管气相色谱法的广泛应用使得多糖的分析更加简便快捷高碘酸氧化和Smith降解高碘酸可选择性断裂糖分子中的邻二羟基或邻三羟基处，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量进行，每开裂1个C-C键消耗1分子高碘酸。通过测定高碘酸的消耗量及甲酸的释放量，可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度、分支多糖的分支数等Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后酸水解，再鉴定水解产物，从而推断糖苷键的位置与分支点等甲基化分析甲基化分析可用于阐明多糖中各单糖间的连接方式分析步骤是先将多糖中单糖残基中的游离羟基转变为甲氧基，进而水解成各种甲氧基单糖，然后还原成相应的阿尔迪醇，再乙酰化，得到部分甲基化部分乙酰化的单糖醇，进行GC－MS分析。从GC的保留时间和质谱图谱，与标准品对照，判断糖的组成和连接方式1、红外光谱法在多糖的结构分析中可用于确定判断其主要官能团，如－OH、C－O－C、C=O、－NH2等，且直接判断呋哺糖的糖苷键构型，如含有甘露糖残基，则出现810cm-1和870cm-1的特征吸收峰物理分析方法2、核磁共振(NMR)分析1H－NMR主要用于确定糖苷键的构型，13C－NMR在多糖结构上的分析比1H－NMR广，与十分拥挤的1H－NMR谱相比，13C－NMR谱线很少重叠，化学位移可达200ppm，共振信号分得较开，容易分辨，可以用来确定糖残基的相对数量、糖链的连接位置、某些单糖种类及异头碳的构型，因而在多糖的分析中起重要作用3、质谱法(MS)通过该方法可得到序列分析和结构鉴定的重要信息，早期使用电子轰击质谱法，新的电离方法有化学电离(CI)、场解析(FD)、二次电离(SI)、快原子轰击(FAB)和激光解析(LD)等FAB-MS适合于分析极性大、难挥发、热不稳定的样品。在快原子轰击过程中，样品通过正离子方式增加一个质子或阳离子，或通过负离子方式失去一个质子产生准分子离子作为谱图的主要信号，并给出反映连接顺序等信息的碎片。因此FAB-MS不仅可以测定寡糖及其衍生物的分子量，还可以测聚合度高于30的糖的分子量、确定糖链中糖残基的连接位点和序列快原子轰击质谱(FAB-MS)4、圆二色谱(CD)一束平面偏振光可以看成是由频率和振幅相同的左、右圆偏振光迭加而形成的，当这两束偏振光通过光活性介质时，如果它们的波长在该光活性的生色团的吸收范围内，由于光吸收的不同，透射后的两束光的振幅有不同的减少，这样透射光的迭加就形成了一个椭圆偏振，这种现象称为圆二色性，通过记录不同波长处所对应的椭圆率θ就得到圆二色谱。从CD可以知道绝对构型、构象等信息，是研究多糖的三维结构的有效办法。中性多糖因缺少一般紫外区可提供信息的结构，难以直接得到由CD谱提供的结构信息，通常可进行衍生化或者将多糖与刚果红络合后测定5、气质联用(GC-MS)气相色谱与质谱联用可以得到有关单糖残基类型、链的连接方式、糖的序列和糖环形式、聚合度等多种结构信息。气相色谱要求试样具有良好的挥发性和热稳定性，多糖为大分子物质，不能直接挥发，不适用于气相色谱，因而将大分子多糖降解为结构单糖或寡糖，并且将其衍生成具有易挥发，对热稳定的衍生物。一般衍生方法有三甲基硅烷化、三氟醋酸酯衍生化和糖醇醋酸酯衍生化等6、原子力显微镜(AFM)AFM用很尖的探针扫描待测样品表面。探针附在一根可活动的微悬臂的底端上，当探针与样品接触时，产生的微小作用力引起微悬臂的偏转，通过光电检测系统对微悬臂的偏转进行检测和放大，信号经过转换可得到样品的三维立体图像。探针是其核心部件。AFM样品的载体可用云母片、玻璃片、石墨等，其中最常用的是新剥离的云母片7、毛细管电泳法(CE)毛细管电泳法(CE)是利用带电粒子在高压电场中，由于迁移速率不同而达到分离目的的一种新技术。其检测方式有紫外可见检测、激光诱导荧光检测、电化学检测等。由于糖类物质不带电，为了使中型多糖类药物在电解质中易于迁移，可用硼酸盐络合剂法由于糖类缺乏极性及紫外或荧光发射基团，一般仍采用衍生化的方法进行寡糖结构分析以提高灵敏度，常用的衍生化试剂有2-氨基吡啶、6-氨基喹啉、7-氨基-1,3-萘二磺酸、3-(4-羧基苯甲酰基)-2-喹啉羧基醛(CBQCA)、四甲基若丹明、3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮(PMP)等。肼类试剂在糖的毛细管电泳柱前衍生中具有很好的应用前景。对肼基苯磺酸具有紫外吸收基团，其磺酸根易于电离，是较理想的衍生试剂糖类的毛细管电泳的检测方式常用的有紫外检测(UV)、电化学检测(EC)、激光诱导荧光检测(LIF)等。紫外检测最方便，是绝大多数商品仪器的主要检测手段，其缺点是灵敏度低，检测限在pmol范围，可分为直接检测和间接检测。电化学检测常用的方法有安培和电导法8、X-射线衍射法(XRD)由于X-射线的波长在0.01～10nm范围内，与晶体中原子间距相当，所以当X-射线通过晶体时，可以引起晶体中原子的电子振动。振动的电子能发出与入射X-射线波长相同的次级射线，这些原子的次级射线就会发生干涉现象，使之叠加或相互抵消，即所谓的衍射。X-射线衍射法可得到晶体的晶胞参数和晶格常数，再加上立体化学方面的信息包括键角、键长、构型角和计算机模拟，就可以准确的确定多糖的构型多糖通常是不能结晶的，但在适宜的条件下，它可以微晶态存在。所以进行衍射分析的样品必须通过外界的诱导使其中有相当部分呈现微晶态。这可以通过多种途径来实现。最简单的方法就是将多糖溶液置于纤维扩张器中，让其在控制的湿度条件下干燥即可。由于多糖的性质差异大，不同的样品所采用的方法应根据实际情况而定。对于碱性条件下可溶，中性不溶的样品则可先制成碱性溶液，而后对水透析，所得的胶体进一步处理后就可进行衍射；对于某些具有热溶性而冷溶性不好的样品则可先制成热溶液，然后迅速冷却得到适宜的样品，由此方法得到的样品易碎，最好是用水和二甲基亚砜的混合溶液进行以上操作多糖一般都形成螺旋体结构，所以还必须求得螺旋体的参数。采用螺距、对称性及其它立体化学限制因素来描述分子模型，突出的难题是螺旋采用右旋还是左旋，分子是单螺旋还是多螺旋。所以结构的确定还需进行优化直至只有一种模型能明显优于其它模型为止构效关系多糖的构效关系就是指多糖的一级结构和高级结构及理化性质与其生物活性的关系，是当前糖化学和糖生物学共同关注的焦点问题1、多糖一级结构与生物活性的关系多糖的糖组成和糖苷键类型的影响对其生物活性有一定的影响如从菌体中提得的活性多糖一般由葡萄糖组成，而且葡聚糖主链上的β-1,3甙键和支链上的β-1,6甙键为必须如香菇多糖的具有β-D-1,3吡喃葡聚糖主链，C6上带有分支侧链，β-1,3和β-1,6结合的侧链共存是