食品酶学实验指导书

食品酶学实验指导书陆剑锋、孙汉巨2009年03月实验一果胶酶的特性及其应用一、实验目的1.掌握果胶酶活性的检测方法；2.了解与掌握果胶酶的特性；3.了解果胶酶在果汁澄清中的作用；二、实验原理果胶质是指植物中呈胶状的聚合碳水化合物，是植物细胞间层和细胞壁的重要组分。果胶质由三种化学成分：α-l，4-聚-D-半乳糖醛酸、阿拉伯聚糖和β-1，4-D-半乳聚糖。果胶质按其分子中D-半乳糖醛酸上羧基酯化程度不同，可分为原果胶、果胶酸和果胶酯酸。果胶是多缩半乳糖醛酸甲酯，为白色或黄褐色的粉末，溶于20倍的水则成粘稠状液体，与三倍或三倍以上的砂糖混合，更易溶于水，对酸性溶液较对碱性溶液稳定，不溶于乙醇及其它有机溶剂。果胶酶(EC.3.2.1.15)是分解植物主要成分果胶质的酶类，与纤维酶相似，是一群酶，至少有8种酶分别作用于果胶分子的不同位点，基本上分为解聚酶和果胶酯酶两大类。前者能催化果胶解聚，后者能催化果胶分子中的酯水解。果胶水解酶澄清果汁分两步完成。首先由果胶酯酶切断果胶的甲酯基，生成果胶酸和甲醇，紧接着液化型的果胶酸酶使果胶质低分子化，生成带羧基的产物。多数羧基会与金属离子或其他成分结合而凝聚。这是可能发生二次沉淀的原因。果胶酶广泛地分布于高等植物(胡萝卜、番茄、草莓、香蕉、桔子等)和微生物中。果胶裂解酶的生产局限于霉菌。其高产菌株多为曲霉和青霉属。解聚酶来自于霉菌、细菌等微生物和胡萝卜等植物中。果胶酯酶除在水果和蔬菜中存在外，在细菌相霉菌亦有发现。能引起橙、梨、苹果和香蕉腐败的微生物基本上都能产果胶酶，因为这些水果中果胶含量高。有利于分解果胶的微生物的生长和发育。虽然有不少微生物都能产果胶酶，但在工业生产中常采用真菌，例如产酶活力高的曲霉、青霉、核盘霉等。果胶酶主要应用于食品工业，特别是水果加工。由于果汁粘度高，致使过滤困难和产率低。果实经破碎后榨汁，果胶溶出在果汁内，造成果汁浑浊，在储存中又会发生沉淀。利用果胶酶分解果汁中的果胶，是果汁和果酒澄清的最好方法，已广泛应用于苹果汁、葡萄汁、草莓汁和柑桔汁等的生产。果胶酶的加量按成品酶活力而定，一般为0.003％-0.1％，在pH值为3-5,35～55℃条件下作用2-12h。用前以果汁或水将酶稀释10-20倍。果浆用酶和果汁用酶均不能与酶同时使用膨润土、多酚物质和SO2（浓度要小于500mg/L）。为了检查澄清效果，可将一份果汁与二份（95%乙醇99∶浓盐酸1）混合液混合均匀，15分钟后观察，果胶分解完全则无絮状物出现。贮存：本品最佳贮藏条件为4-10℃，一般为室温贮藏，避免阳光直射。三、实验材料与仪器橘子等，果胶酶，95%乙醇。721分光光度计；恒温水浴；离心机；移液管0.5、5毫升；离心管；温度计；试管；试管架；玻璃烧杯；比色管。四、操作步骤（一）温度对果胶酶活力的影响1．取9支比色管，分别放入约10毫升橘汁，再分别加入1%浓度的果胶酶（0、0.1、1）毫升，再补加蒸馏水至总体积22毫升。充分摇匀，置恒温水浴中于35、45、55℃温度下反应2h。2．反应结束后，将反应液放入离心管中进行离心分离（3000rpm，5min）。3．取上清液用蒸馏水稀释5倍后于721分光光度计于600nm处测吸光值。4．计算果汁澄清度（%）=（OD对照-OD）÷OD对照×100式中：OD对照——对照的吸光值（用蒸馏水代替酶液，与反应液同样操作）；OD——酶反应液的吸光值。5．根据在三个温度下果汁的澄清度的比较，取澄清度最高的温度为最适温度（见表1-1）。表1-1温度对果胶酶活力的影响实验序号温度（℃）果汁澄清度（%）结果135—23445—56755—89（二）pH值对果胶酶活力的影响1．取9支比色管，分别放入约10毫升橘汁，再分别加入1%浓度的果胶酶（0、0.1、1）毫升，每3个比色管分别补加pH为3、4和5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液至总体积22毫升。充分摇匀，置恒温水浴中于45℃温度下反应2小时。2．反应结束后，将反应液放入离心管中进行离心分离（3000rpm，5min）。3．取上清液用蒸馏水稀释5倍后于721分光光度计于600nm处测吸光值。4．计算果汁澄清度（%）=（OD对照-OD）÷OD对照×100式中：OD对照——对照的吸光值（用蒸馏水代替酶液，与反应液同样操作）；OD——酶反应液的吸光值。5．根据在三个pH下果汁的澄清度的比较，取澄清度最高的pH为最适pH（见表1-2）。（三）加酶量对果汁澄清的影响以横坐标为添加的酶量，纵坐标为澄清度，作坐标图。用上述方法测定时，果汁的澄清度与酶量之间的关系在澄清度80%以下时，基本上近似直线，澄清度在80%时，肉眼也能看到几乎是透明的，因此将此作为反应终点。把添加0.1毫升和1毫升分别的澄清度，在坐标图上连接起来。找出澄清度达到80%时的最少使用酶量作为所需酶量。（四）果胶酶活力的确定在（三）的条件下，能使1毫升果汁有80%澄清的酶活力定为1单位。酶澄清果汁的活力（μ/ml）=d÷V×5式中：d——酶的稀释倍数；V——所需酶量（ml）。（五）果汁中果胶的检验分别取在不同条件下作用2小时的果汁2.5毫升置比色管中，加入95%乙醇至总体积10毫升，振荡。因果胶不溶于乙醇中，如有果胶存在，则有浑浊和沉淀生成，比较浑浊生成量，可知果汁经果胶酶澄清效果。表1-2pH值对果胶酶活力的影响实验序号pH果汁澄清度（%）结果13—2344—5675—89五、附录：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L），3.0—6.20.1mol/L柠檬酸：含C6H8O7.H2O21.01g/1000ml；0.1mol/L柠檬酸三钠：含Na3C6H5O7.2H2O29.40g/1000ml。pH0.1mol/L柠檬酸(xml)0.1mol/L柠檬酸三钠(yml)pH0.1mol/L柠檬酸(xml)0.1mol/L柠檬酸三钠(yml)3.03.23.43.63.84.04.24.44.682.077.573.068.563.559.054.049.544.518.022.527.031.536.541.046.050.555.54.85.05.25.45.65.86.06.240.035.030.525.521.016.011.58.060.065.069.574.579.084.088.592.0实验二多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶活力的测定一、目的掌握多酚氧化酶及抗坏血酸氧化酶的测定方法。二、原理测定果实、蔬菜保鲜中氧化酶的动态，对了解植物的代谢情况及其与环境条件的关系有重要意义。抗坏血酸氧化酶会使抗坏血酸氧化而变成黄褐色的脱氢抗坏血酸；多酚氧化酶使焦儿茶酚（邻苯二酚）氧化产生黑素类，使果实蔬菜在不适宜的贮藏条件下品质变劣。抗坏血酸氧化酶的测定是在该酶的最适pH及适宜温度下，向反应瓶中加入一定量底物（抗坏血酸及酶液）。根据抗坏血酸的消耗量计算酶活力。抗坏血酸消耗量可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来测定。KIO3十5KI＋2H3PO4→3I2十2K3PO4十3H2O抗坏血酸十I2→脱氢抗坏血酸十2HI在氧的存在下，多酚氧化酶将邻苯二酚氧化为醌类，醌又进一步氧化抗坏血酸为脱氢抗坏血酸。向反应系统中加入焦儿茶酚和抗坏血酸，可由抗坏血酸的消耗量间接求得多酚氧化酶的活力。三、材料、仪器和试剂l．材料新鲜的马铃薯或苹果等。2．仪器电冰箱，组织捣碎机，恒温水浴锅，离心机，三角瓶50毫升（×6），刻度吸管5毫升（×1）、2毫升1（×2）、1毫升（×2），微量滴定管（×2），秒表。3．试剂(1)pH6、0.05M磷酸盐缓冲液（0.2MNa2HPO412.3ml，0.2MNaH2PO487.7ml，稀释4倍）(2)0.1%抗坏血酸使用当天配制。(3)0.02M焦儿茶酚（邻苯二酚）称取0.22克焦儿茶酚溶于100毫升水中，使用当天配制。(4)10%偏磷酸(5)1%淀粉溶液(6)0.005M碘液碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1M碘酸钾（0.3567克碘酸钾溶于水，定容至100毫升）12.5毫升，用蒸馏水定容至250毫升。四、操作1.酶液制备将新鲜马铃薯或苹果8克（去皮），切碎后置组织捣碎机内，加入约60毫升左右pH6的磷酸盐缓冲液（预先置冰箱内冷却），捣碎3分钟后将全部材料用缓冲液洗入100毫升容量瓶内，并定容至刻度。在20℃水浴上浸提30分钟，中间摇动数次。将匀浆离心（2500转/分，10～15分钟），取出上清液（酶液）备用。2.测定取6个50毫升干燥的三角瓶，标号后按下表准确加入试剂。抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶测定试剂加量表试剂(毫升)瓶号蒸馏水抗坏血酸焦儿茶酚酶液偏磷酸备注①422抗坏血酸氧化酶②422抗坏血酸氧化酶③4221空白④3212抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶⑤3212抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶⑥32121空白向各瓶内加水、抗坏血酸。向④、⑤、⑥号瓶加焦儿茶酚。向③、⑥号加偏磷酸。于20℃水浴预热3～5分钟后分别测定。向底物中加入酶液2毫升，立刻记时，混匀。20℃保温3分钟后立即加入1毫升偏磷酸（③、⑥号不必再加）杀酶。加淀粉溶液3滴，用0.005M碘液滴定至浅兰色为止。记录各号之滴定值。五、计算以每克鲜样品每分钟氧化抗血酸的毫克数表示酶活力。抗坏血酶氧化酶活力(单位／克)=[③-(①+②)/2]×0.44×n÷W÷(3×2)多酚氧化酶活力(单位/克)=[(⑥-(④+⑤)/2)-(2③-①-②)/2]×0.44×n÷W÷(3×2)式中0.44——每毫升0.005M碘液氧化抗坏血酸毫克数。n——酶提取液体积（毫升）。W——鲜样品重量（克）。由于酶液中同时存在以上两种酶，所以测定多酚氧化酶的反应系统中(④、⑤、⑥号)的抗坏血酸的消耗量是两种酶作用的结果。在计算中要减去抗坏血酸氢化酶的底物消耗量。实验三碱性磷酸酶活性功能基团的化学修饰一、实验目的1.使学生了解与掌握酶化学修饰的方法；2.使学生了解酶化学修饰后的性质变化。二、实验原理N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）在一定条件下能比较专一地与蛋白质分子中色氨酸残基侧链基团起反应，从而改变咪唑基的化学性质。若色氨酸残基是酶活力所必需的，经NBS修饰后，酶活力完全丧失。并在278nm处的紫外吸收值下降。碱性磷酸酶（ALPase）酶活性中心含有一个色氨酸残基，是酶活力表现所必需的。在NBS修饰过程中，随着NBS浓度增大酶活力逐渐下降，最终完全失活。酶的紫外吸收光谱特征发生了明显的变化，278nm特征吸收峰随着NBS浓度的增大而逐渐下降至消失。三、实验材料1.仪器恒温水浴锅，722分光光度计，50μL微量进样器，秒表，贝克曼UV-650分光光度计。2.试剂（1）0.1mol/LNaAc-HAc缓冲液（pH4.5）：0.1mol/LNaAc48mL+0.1mol/LHAc52mL。（2）2mmol/LNBS：准确称取178mgNBS溶于50mLpH4.5、0.1mol/LNaAc-HAc中。（3）1mmol/LNBS。（4）测定碱性磷酸酶活力试剂：（底物溶液的终浓度含0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液，pH10.1，2mmol/LMgCl2，5mmol/LpNPP）（5）0.1mol/LNaOH。（6）0.01mol/LTris-HCl（pH7.5）。（7）0.1mol/Na2CO3-NaHCO3pH10.1缓冲液：分别取0.1mol/LNa2CO3溶液（取28.6gNa2CO3·10H2O溶于1000mL蒸馏水中）70mL和0.1mol/LNaHCO3溶液（取8.4gNaHCO3溶于1000mL蒸馏水中）30mL混匀，用酸度计准确调节pH10.1。（8）0.5mol/L醋酸镁溶液：称取醋酸镁107.25g溶于蒸馏水中，稀释至1000mL。（9）0.1mol/L醋酸钠溶液：称取醋酸钠8.2g溶于蒸馏水中，稀释至1000mL。（10）0.01mol/L醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。（11）底物溶液（5mmol/