转基因猪中蛋白高效表达的新途经

转基因猪中蛋白高效表达的新途经的研究摘要：如何使转基因动物中特定基因的蛋白高效表达一直是研究的热门，这里我们将描述一种新型的旁路蛋白表达途径，利用由睡美人转座子介导产生在两个种系的转基因猪中荧光蛋白表达。我们发现荧光蛋白的cDNA没有用于编码分泌途径的信号肽，且在先前的研究中，发现了转基因动物荧光蛋白定位在细胞质中。更重要的是，在哺乳期的母猪的乳汁样品中检测到了高含量具有生物活性的Venus或mCherry荧光。分析表明，这是由乳腺上皮细胞脱落进入乳汁中，这是第一次在牲畜乳汁中对报告荧光的描述，这极有可能改变现有的通过乳房产生重组蛋白的概念。关键词：转基因猪睡美人转座子重组荧光蛋白引言：小鼠和很多牲畜的的乳腺已经成为当今大规模生产重组蛋白的生物反应器。一般来说，通过挤奶的方式获得转基因动物重组蛋白的方法最为常见。现今，通过这种方法，人类乳铁蛋白、α-乳清蛋白、酸性α-葡萄糖苷酶、白蛋白和溶菌酶都有了较高的产量。第一个转基因牲畜在1985年获得，在此之后，大量研究者进行了牲畜从组蛋白产生的研究，并且取得了很好的成果。其中包括，转基因猪生产的牛α-乳清蛋白，人类凝血因子Ⅷ，重组的人凝血因子IX和溶菌酶；转基因牛提升β和κ-酪蛋白、人乳铁蛋白的产量，转染色体牛用于生产人类抗体血清。转基因山羊被用来产生重组人类溶菌酶，人类抗凝血酶III和重组丁酰胆碱酯酶；转基因绵羊用来表达产生人凝血因子IX；被用来表达类胰岛素因子Ⅰ，人类酸性α-葡萄糖苷酶的转基因兔也已经出现了。目前，转基因山羊和转基因兔产生第一批重组药用蛋白——重组抗凝血酶和C1酯酶被欧洲药物管理局（EMA）和美国食品药品监督局(FDA)批准上市。然而，在研究中发现，在一些转基因动物乳汁中，仅能检测到微量的重组蛋白。通常，乳腺中特异性启动子和调控元件，如酪蛋白、乳球蛋白和乳白蛋白启动子元件，在哺乳期内被用于靶向攻击在乳腺上皮细胞中重组蛋白的表达。从重组蛋白的产生到乳汁分泌需要氨基末端信号肽，使新生肽段进入内质网，然后由高尔基体包装将成熟的蛋白质运送到分泌小泡中，与细胞膜融合并释放其中的蛋白到乳腺的内腔中。1.方法综述文章论述了一种不同的方法来使重组蛋白高效表达并且在乳汁中含量提升。之前，在不同种系的转基因猪中。采用睡美人转座子系统——分别使用荧光蛋白Venus和mCherry的cDNA构建报告转座子。两种报告转座子都是受驱动于普遍存在的活性嵌合巨细胞病毒（CMV）和鸡β-肌动蛋白启动子（CAGGS）。Venus和mCherry被设计成在胞浆内表达的重组蛋白。事实上，这一结果从对这些动物的器官、组织和细胞培养的分析中就已经证实了。通过分析哺乳期转座子母猪的乳汁，尽管转基因构建体并未包括将重组蛋白分泌进入乳汁中关键因素的信号肽，但是结果表明，两个报告蛋白Venus和mCherry在乳汁中的含量都达到相当高的水平。此研究的结果可能会成为乳房产生具有生物活性蛋白的另一种方法。2.步骤简述1.分离乳样品和Westernblotting免疫印迹法2.荧光显微镜观察和图像处理3.乳和乳细胞样品凝胶过滤4.信号肽和糖基化位点预测5.糖基化检测3.结果与讨论3.1.结果3.1.1.Venus荧光蛋白在母猪乳汁中的表达通过生物信息学方法分析预测，在Venus和mCherry序列中，无分泌信号序列（图1），而对于现有的猪乳中蛋白有一个清晰的信号肽序列，比如α-S1酪蛋白和β-酪蛋白，使用荧光显微镜可以准确的确认（图2）。乳汁样品来自2只转Venus的母猪和3只转mCherry的母猪，并且用5只非转基因猪作为对照。荧光显微镜图（图2）显示两个乳腺细胞和脱脂奶含有高浓度的Venus蛋白，通过对比显示出脱脂奶含有更高浓度的Venus蛋白，当然不排除Venus是由脂肪胶束途径分泌的可能性。由于没有信号肽共有序列，Venus蛋白并不是通过内质网分泌。一种可能是乳腺上皮脱落的细胞含有留在细胞质中的Venus蛋白进入到乳汁中。为了评估这种可能性，对脱脂奶和细胞组分进行了抗体-Venus和抗体-β微管蛋白的免疫印迹测定，细胞骨架的β微管蛋白能被检测到，这表明在乳房腔内的乳腺细胞的某些成分因为膜受损进入乳汁中。3.1.2.mCherry荧光蛋白在乳汁中的表达水平对3个转mCherry的转基因猪乳分析，在乳腺细胞部分的mCherry是容易被观察的（图4），高mCherry的部分的颜色在白光照明下偏红。提取的乳腺细胞中的mCherry通过柱纯化和表达富集，通过与mCherry抗体的免疫印迹确认。但是，结果显示，初乳中检测不到mCherry报告蛋白，从第三天开始，mCherry在乳腺细胞中表达，然后在一个较高水平一直到断奶时间。在脱脂奶中，mCherry在第六天可被检测到，然后一直存在直到断奶，但比在乳腺细胞中的水平要低。总的脱落细胞数量和转基因母猪以及普通母猪的乳汁中相差不大。3.1.3.对潜在的Venus和mCherry糖基化以及分泌进入血浆因素的分析为了确认Venus和mCherry的运输途径是通过乳腺上皮细胞脱落进入乳汁，分析了重组报告蛋白再翻译后是否用N-和O-糖基化修饰，糖基化修饰是一种常见的在分泌途径加工过程中蛋白翻译后修饰。对脱脂奶的组分中加入去糖基化的N-糖酰胺酶F和O-糖苷酶后，没有显示表明重组蛋白糖基化修饰。为了检测报告蛋白是否进入除了乳汁的其他体液里，先取血液样本，分离血浆和血细胞，并用Venus和mCherry的抗体进行免疫印迹测定。结果只在一个代表Venus含量最小的样品中检测出来，因为血液循环系统对凋亡或破损细胞极高的清楚效率使得这些细胞无法在血浆中积累。总的来说，上述数据可以表明报告蛋白定位在蛋白质中。3.2.讨论在此描述了在两种转基因猪体内的重组报告蛋白的表达，转座子的结构设计证明了编码的Venus和mCherry是定位在胞浆中的，和以前的研究相吻合。数据表明，重组的Venus蛋白和mCherry蛋白不通过经典分泌途径表达，而是通过乳房上皮细胞的凋亡掉落讲Venus和mCherry蛋白送入乳汁中。在哺乳期中，乳房上皮细胞增殖快速，健康的哺乳期母猪产奶每升中含有108-1010个细胞，这一数量比在牛奶中（每升0.009×109个细胞）高得多。乳细胞是凋亡的细胞中的一种，并且能激活泌乳细胞，乳腺上皮细胞和免疫细胞。初乳中通常含有数量较多的免疫细胞，在进入哺乳期一周后，大多数（＞95%）是由泌乳细胞和上皮细胞组成。数据表明，在初乳中，报告蛋白呈阴性，在一周之后的成熟乳中，报告蛋白呈阳性，随后报告蛋白在脱脂乳中延迟出现。这表明报告蛋白位于乳腺上皮细胞中。在乳腺上皮细胞胞浆中，不允许重组蛋白的N-和O-糖基化修饰，这个修饰原本应该发生在内质网和高尔基体的内侧。然而，之前的一些研究表明，重组蛋白在乳腺中的表达可能会导致错误的糖基化修饰，例如在牛和鼠乳中制备重组人乳铁蛋白时已经观察到这一现象。因此，在乳细胞胞浆中存在的重组蛋白不要求被生物活性的糖基化修饰而成为蛋白质，其可以在体外糖基化。在乳腺上皮细胞胞浆中表达的一个特别的优点是在重组蛋白通过乳房管腔中的时候避免被降解，或者通过脂肪交束聚集，可以简化其复杂过程。呈散表达的Venus和mCherry荧光蛋白可以在转座子母猪的乳汁中大量得到，且SB转座子系统已经在大量通过乳房作为生物反应器的动物中成功进行了转基因。总的来说，我们建立了存在于胞浆中的重组蛋白的产品，这个基因是被一个强大的且普遍存在的启动子所驱动，这可能会代替现有的转基因母猪乳中蛋白高水平表达的概念和方法。