转录辅助之转录校正

Transcript-AssistedTranscriptionalProofreading转录（Transcription）是遗传信息从DNA流向RNA的过程。即以双链DNA中的确定的一条链（模板链用于转录，编码链不用于转录）为模板，以ATP、CTP、GTP、UTP四种核苷三磷酸为原料，在RNA聚酶催化下合成RNA的过程在转录过程中，核苷酸合成的保真度是稳定遗传和基因准确表达的主要决定因素。由该机制确保DNA转录依赖RNA聚合酶的保真度尚不完全清楚。在这里，新生转录物的近3'端核苷酸通过提供活性基团和配位键给RNA聚合酶活性中心，刺激倒数第二个磷酸二酯键的水解。这种刺激在核苷酸错误插入这一过程中存在的几率更高。DNAActivecenterGA'RNA5’3’ActivecenterMg2+Mg2+N第一个第二个图1.（A）催化反应的不同状态转录延伸复合物特性的示意图。红色圆圈代表一个包含两个镁离子活性中心。MECs(misincorporatedelongationcomplexes)错误插入延伸复合物CECs(correctelongationcomplexes)正确延伸复合物研究表明，非互补的NTPs结合到RNAP的E位点后（在活性中心的附近），刺激P1裂解。APcPP（5'-(α,β)-亚甲基腺苷三磷酸）阻止匹配或不匹配的核苷酸结合到新与模板DNA上+2位点的鸟苷酸配对，进而在CECs中刺激P1的裂解，在MECs中则没有这种刺激图1（B）MECs（泳道1至6个，13至24）和一个对应的CEC（泳道7至12）（与CMP在RNA3’端作为一个例子）。对于每个MEC中，第一个字母表示错误插入的3’NMP和括号里面是正确的核苷酸（图S1）。（C）CEC和MECs为15毫摩Mg2+和1mM非互补、非水解的NTP（APcPP)。非互补的核苷三磷酸通过稳定MgⅡ来激活P1裂解,MgⅡ通过与β和α磷酸相互作用而稳定。因为3'-末端核苷单磷酸里没有这些磷酸，MgⅡ的协同作用和P2裂解可能由末端核苷单磷酸本身刺激的。这种假设预测依赖MgⅡ的P2裂解，会影响MgⅡ与化合物的亲和性，其解离常数应该比P1水解固有的常数低。(表1)观测到的最低的Kd值与由非互补核苷三磷酸激发的P1水解的Kd值相近。因此，3'-末端的单磷酸腺苷，无论匹配或不匹配的，通过增加MgⅡ的亲和力来增加P2的裂解速度。•P2裂解的高速率不可能仅仅因为MgⅡKd值的降低，因为裂解速率在饱和MgⅡ浓度下取决于3'-末端核苷单磷酸本质的不同。例如，3'-末端的复合物包含A,G,或者U被C取代后比较（图1:2、7和15行）表明裂解反应的Kcat值在不同的复合物中显著差异不同（分别是0.14,0.028，和0.015s-1。表明3'末端的NMPs直接或间接参与了裂解反应MECs中P2裂解的Kcat(催化常数）是由反应本身特性决定，在CECs中中受模版链3’末端碱基配对的强烈影响。为了避免复杂化，我们只研究错误插入延伸复合物。Fig.2.Modificationsofmisincorporated3'-terminalnucleotidesusedinthisstudy.AschematicrepresentationoftheactivecenterofRNAPinMECthatisconsistentwithourfindingsisshownontheleft.Structuresofmodifiedbases,phosphategroups,andsugarsareshown.•为了检验3’-末端核苷单磷酸的哪一个化学基团参与MgⅡ稳定和P2水解，我们确定了RNAs错误插入延伸复合物中裂解反应的Kd和Kcat,包含对3’末端磷酸，糖，和碱基的化学修饰（图2）。研究结果•对于错误插入的腺苷5′-单磷酸，其中P1的一个氧与3’-羟基作用，这反过来协调MgⅡ。另一个P1氧定位活性水分子。2’-羟基不参与反应。•对于错误插入的鸟苷5′-单磷酸（GMP），其中P1的一个氧定位活性水。2’和3’-羟基不参与反应。嘌呤环的N-7协调MGⅡ。•对于错误插入的胞苷-磷酸，在C-MECs中裂解反应的序列依赖是由于P1键定位的差异。在复合物的一种类型中,P1与3’-羟基相互作用,来协调MgII。在其他配合物中,这种相互作用是不存在的,并且3’-羟基不与MgⅡ结合成螯合物。定位在活跃的水分子中的P1也参与形成氢键。2’-羟基是可有可无的。在碱基位置3的氮与MgII结合成螯合物。•最后，对于错误插入的尿苷-磷酸，P1与3’-羟基相互作用,定位它来协调MgII或来定位活性水分子。P1还参与活性水分子的协调。2’-羟基是可有可无的。在碱基位置4的酮基不是定位水分子就是作为一般碱基/酸和N-3一起行动。•总的来说,在转录物3’末端错误插入的核苷酸参与他们自身的切除。前面描述的通过非互补的核苷三磷酸的转录物裂解的刺激被认为是底物辅助催化，与之相比较，这里描述的这种反应代表产物辅助催化,并且因此,可以直接影响转录的保真度。•为了表明通过P2裂解的错误插入核苷单磷酸的切除可以防止错误插入核苷单磷酸的转录作用,我们用模板上+2(MECs)核苷三磷酸配对来监控转录物延伸(图3)。在100μM核苷三磷酸,只有5-13%的MECs(30%G-MEC)参与了RNA的延伸,而其余RNA被裂解了,因此,错误插入的核苷三磷酸被删除了(图3b)。在1mM核苷三磷酸的存在下(生理浓度),复合物的-30%(50%G-MEC)延伸了过去错误的核苷单磷酸,而其余部分后行裂解(图3b)。当核苷三磷酸和转录裂解因子GreA添加到一起,被检测到非常低的插入（对于G-MEC除20％）,以及不匹配的核苷单磷酸被删除(图3b)。•因此,受错误插入核苷酸刺激的裂解足以校对大部分错误掺入事件。此活动受转录裂解因子刺激,这转录裂解因子有助于保持转录的忠实性以及在RNA聚合酶的活性位点通过直接稳定MgII来实现。•对无错基因表达的转录校对的重要性被提出来了。此外,包含错误插入核苷酸的复合物缓慢地延伸RNA,这将阻碍转录基因的积极表达以及可能干扰DNA复制。裂解因子不能单独负责错误插入核苷酸的去除,因为它们对于细胞来说不是必需的。我们的结果显示一种校对机制,在没有裂解因子的条件下可能就足够控制转录错误插入。这种机制,可能在进化上是保守的,也允许错误地并入RNA的2'-脱氧核苷酸的去除,因为核糖和2'-脱氧核苷酸以相同的效率裂解。•在RNA蛋白领域里，当RNA聚合酶复制RNA基因组时，RNA聚合酶催化合成的相对低的保真度在没有裂解因子的条件下已经不能足以稳定大型RNA基因组。类似于此处所描述的一项校对和修复机制能允许最后共同的祖先大型RNA基因组存在。