马铃薯中消炎成分的提取及其消炎作用的比较研究

21摘要目前马铃薯用于消炎止痛时一般采取现切现用、以马铃薯片敷于患处的方法，但是片状马铃薯久放或贴敷后变色，需频繁更换，使用不便。本实验拟提取马铃薯中的主要消炎成分、进行定性、定量分析，并将主要消炎成分制成软膏，以小鼠皮肤炎症模型比较马铃薯软膏、马铃薯片与消炎药物的疗效。关键词马铃薯消炎生物碱水溶性维生素马铃薯提取物软膏1前言马铃薯又名土豆、洋芋、山药蛋、薯仔、茨仔等，富含淀粉、蛋白质、多种维生素及矿物质等，一直深受百姓喜爱。同时作为中草药的一种，马铃薯也常被中医用作和胃健中、解毒消肿的天然药物。马铃薯性平味甘，具有抗感染、解毒、消肿镇痛、缓解痉挛、促进细胞再生和伤口愈合等作用，对人体无刺激，副作用小。以片状马铃薯贴敷患处的方法来消除红肿及疼痛已经广为人知，并有显著效果。临床常用马铃薯片来缓解肿瘤病人因化疗而导致的外周静脉输液外渗性损伤，而且效果比50%硫酸镁更有效，即使长期使用也不会产生消炎止痛膏的毒副作用及依赖性。但是片状马铃薯在使用上存在一定弊端，如必须现切现用、贴敷时需经常更换、水份容易蒸发等，给病人的使用带来了很大的不便。因此需要寻找一种更好的利用马铃薯消炎的替代方法。本实验拟提取马铃薯中消炎的有效成分，并将主要消炎成分以不同配比制成软膏，以动物模型比较马铃薯软膏、马铃薯片与消炎药膏的消炎效果。2实验目的提取马铃薯中消炎的主要有效成分并制成软膏，鉴定马铃薯软膏的消炎效果，为临床探索一种利用马铃薯消炎的最佳方案。3实验原理3.1马铃薯中消炎成分分析马铃薯中的龙葵碱（茄碱）具有兴奋平滑肌和加强血液流通作用。维生素B2参与糖、蛋白质及脂肪的代谢，可保护皮肤免受炎症的侵害；维生素B1能激活胆碱乙酰化酶，有维持神经系统的功能及抗神经炎的作用，从而防止病人皮肤受损，减少医源性损害。3.2龙葵碱和水溶性维生素的提取3.2.1龙葵碱22马铃薯中所含的生物碱主要为龙葵碱，其化学结构见图1。大多数生物碱几乎不溶于水或难溶于水，易溶于乙醇、甘油等有机溶剂。图1龙葵碱的化学结构3.2.2维生素B1维生素B1的化学结构见图2，在酸性溶液中很稳定，在碱性溶液中对热极不稳定，易被氧化和受热破坏。3.2.3维生素B2维生素B2（结构见图3）能溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液，在酸性条件下也有一定的溶解度，对空气、热稳定，且在酸中非常稳定，即使短时间内高压加热亦不至于破坏。但在碱性溶液中则较易被破坏。游离核黄素对光敏感，特别是紫外线，可产生不可逆分解。图2维生素B1的结构图3维生素B2的结构本实验选用制药时常用的提取剂——盐酸一次提取维生素B1和B2。在酸性条件下维生素B1和B2都有一定的溶解度，且化学性质比较稳定。3.3龙葵碱和水溶性维生素的鉴定3.3.1龙葵碱的鉴定龙葵碱的鉴定有沉淀反应和显色反应两种。但由于马铃薯含大量蛋白质及多糖，对沉淀反应影响较大，所以选用显色反应。在稀硫酸中龙葵碱与甲醛溶液作用生成橙红色化合23物。3.3.2水溶性维生素的鉴定利用重氮苯磺酸反应鉴定维生素B1：在碳酸氢钠存在的碱性条件下，硫胺素可与重氮苯磺酸作用产生红色。维生素B2的乙醇中性溶液和水溶液呈黄色，在中性或酸性溶液中经光照射自身可产生黄绿色荧光，在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比。核黄素能被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物，失去荧光。但此氢化物在空气中易被重新氧化，恢复荧光。3.4龙葵碱和水溶性维生素的定量根据Lambert-Beer定律A=KCL计算龙葵碱、维生素B1、B2的质量浓度C(mg/ml)，并转化为50g马铃薯中的含量。其中A为吸光度；L为比色皿厚度单位是cm；K为吸光系数，在入射光的波长、溶液种类和温度一定的条件下K为定值：530nm波长处龙葵碱的吸光系数K为177；246nm波长处VitB1的吸光系数K为421；444nm波长处VitB2的吸光系数K为323；L(cm)为比色皿厚度。（上述吸光系数为根据已有文献的实验数据计算而得到[12]）。4实验设备实验主要仪器包括离心机、电子天平、台式酸度计、紫外-可见分光光度计、紫光灯。实验器材主要包括索氏提取器、抽滤装置、研钵、一次性皮试点刺针、计时器、直尺等。5实验材料及试剂5.1实验材料马铃薯（新鲜马铃薯及发芽马铃薯）、小鼠、消炎止痛膏（喜疗妥软膏）。5.2试剂及其配制5.2.1试剂95%乙醇、5%稀硫酸、甲醛；0.01mol/L的盐酸、碳酸氢钠、氢氧化钠、对氨基苯磺酸、浓盐酸、亚硝酸钠、2.5%亚硫酸氢钠溶液（用2%碳酸钠作溶剂）；甘油、明胶；8%硫化钠酒精溶液、花生四烯酸。5.2.2主要试剂的配制碳酸氢钠碱性溶液：取氢氧化钠1g溶于30ml蒸馏水中，加碳酸氢钠1.5g，混匀后，用水稀释至50ml。重氮试剂的配制：溶液A：将对氨基苯磺酸1g溶解于15ml浓盐酸中，然后加水稀释24至100ml。溶液B：将亚硝酸钠0.5g溶解于水中，稀释到100ml。现用现配。需用时，将3ml溶液B加到100ml溶液A中，混匀即得重氮试剂，在冰浴中保存，至少15min后方可使用。此溶液配好后，存放时间不能超过24h。4%花生四烯酸稀释液：取10%食品级花生四烯酸10g溶于25ml无水乙醇中。明胶溶液：称取20g明胶，放入盛有70ml温热（40℃）的甘油和10ml蒸馏水的烧杯中，并使其充分溶解后备用。6实验操作步骤6.1龙葵碱的提取、鉴定与定量6.1.1提取称取50g马铃薯，切成小块，用研钵、研杵稍加研磨后装滤纸筒内。加入3~5ml95%乙醇溶液清洗研钵、研杵后洗液转移入索氏提取器（图4）中。在圆底烧瓶中倒入80ml95%乙醇溶液，在索氏提取器中抽提1~1.5h后，得到龙葵碱提取液，测量提取液的体积为V1，单位ml。图4龙葵碱的提取6.1.2鉴定将少量提取液进行离心，得到滤液，取滤液2ml，加入5滴5%稀硫酸，震荡，充分混合后加入甲醛溶液，如溶液显橙红色，则证明提取液中含龙葵碱。6.1.3定量测定530nm处的吸光度（A530），根据A=KCL，计算龙葵碱的质量浓度C(mg/ml)。530nm波长处龙葵碱的吸光系数K为为177；L(cm)为比色皿厚度。6.2水溶性维生素的提取、鉴定与定量6.2.1提取25在锥形瓶中加入0.01mol/L的盐酸100ml，称取50g马铃薯磨成碎末放入锥形瓶中，用力振荡5min并搅拌5min。放置10min后，用抽滤装置抽滤，将滤液离心后取上清液，备用，标记为维生素提取液，测量提取液的体积为V2，单位ml。注意避光保存。6.2.2鉴定维生素B1的鉴定：取提取液1ml，加入碳酸氢钠碱性溶液1.5ml，再加入重氮苯磺酸，摇匀后，在10min内观察到深红色的出现，则为维生素B1。维生素B2的鉴定：分别取提取液2ml于A、B两试管中，在紫光灯下观察其黄绿色荧光。在A试管中加入5～10滴亚硫酸氢钠溶液，比较两管的荧光。若A试管荧光消失，则为维生素B2。6.2.3定量分别测定246nm、444nm处吸光度（A246、A444），根据A=KCL，分别计算维生素B1、B2的质量浓度C(mg/ml)。246nm波长处维生素B1的吸光系数K为421；444nm波长处维生素B2的吸光系数K为323；L(cm)为比色皿厚度。6.3马铃薯提取物软膏的制备按下表分别取生物碱提取液、维生素提取液、明胶溶液若干，混合，在蒸发皿中加热溶解，再在室温下冷凝为胶状，制备不同配比的马铃薯软膏。表1马铃薯提取物软膏主要成分的配比成分（ml）1号软膏2号软膏3号软膏4号软膏生物碱提取液51051095%乙醇5-5-维生素提取液5510100.01mol/LHCl55--明胶溶液30303030总体积505050506.4马铃薯提取物软膏与马铃薯片、消炎药膏的疗效比较6.4.1小鼠皮肤炎症模型的制备选取同种系、同性、年龄、体重等指标相近的小白鼠共10只，每只小鼠均用8%硫化26钠酒精溶液脱毛，再在后腰两侧位置上用4%花生四烯酸稀释液对称点刺共4处，并作好记号。30min后测定红斑的直径。6.4.2消炎处理将10只皮肤炎症模型小鼠随机分成两组。第一组五只小鼠分别编号为A、B、C、D、E。该组小白鼠点刺部位标记为1~4号位置，消炎处理方法为：1号位置为空白对照，2号位置敷马铃薯片（约1cm×1cm，新鲜制备），3号位置敷马铃薯提取物1号软膏，4号位置涂抹消炎止痛膏。比较不同处理对伤口消肿的作用。消炎处理后每隔10min揭开贴敷处测定红斑的直径。6.5不同配比的马铃薯提取物软膏的消炎作用比较取第二组皮肤炎症模型小鼠共五只，分别编号为甲、乙、丙、丁、戊。该组小白鼠点刺部位标记为a~d位，消炎处理方法：a位敷1号软膏，b位敷2号软膏，c位敷3号软膏，d位敷4号软膏。敷上马铃薯提取物软膏后用保鲜膜包裹贴敷处。在6.4.2确定的消炎处理疗效显著的时间点，测定红斑的直径，比较不同配比的马铃薯提取物软膏的消肿效果。7结果及计算7.1龙葵碱、维生素B1、B2的定性结果龙葵碱的鉴定结果与原因分析；维生素B1的鉴定结果与原因分析；维生素B2的鉴定结果与原因分析；7.2龙葵碱、维生素B1、B2的定量结果龙葵碱的吸光度A530；马铃薯中龙葵碱的含量（mg/50g）=［A530/（177×L）］×V1。维生素B1的A246；马铃薯中维生素B1的含量（mg/50g）=［A246/（421×L）］×V2。维生素B2的A444；马铃薯中维生素B2的含量（mg/50g）=［A444/（323×L）］×V2。7.3马铃薯软膏与马铃薯片、消炎药膏的疗效比较7.3.1皮肤炎症程度的判断表2花生四稀酸点刺30分钟后红斑直径（单位：mm）A小鼠B小鼠C小鼠D小鼠E小鼠1号位272号位3号位4号位结果统计分析：比较红斑直径的均值，分析同一只小鼠四个部位的红斑直径是否存在差异；五只小鼠之间是否存在差异。7.3.2三种消炎方法的疗效比较表3不同消炎方法处理后红斑直径（单位：mm）时间(min)102030405060A小鼠1号位B小鼠1号位C小鼠1号位D小鼠1号位E小鼠1号位A小鼠2号位B小鼠2号位C小鼠2号位D小鼠2号位E小鼠2号位A小鼠3号位B小鼠3号位C小鼠3号位D小鼠3号位E小鼠3号位A小鼠4号位B小鼠4号位C小鼠4号位D小鼠4号位28E小鼠4号位注：1～4号位分别为空白对照、马铃薯片、马铃薯软膏、消炎药膏。结果统计分析：无任何处理时红斑直径的变化（炎症的自愈情况）；每一种消炎方法处理疗效最显著的时间点，寻找三种处理疗效均较显著的时间点。计算疗效最显著的时间点不同消炎方法处理后红斑直径与处理前红斑直径的差值（见表4），以F检验进行统计分析各处理组间是否存在显著差异。表4疗效最显著的时间点不同消炎方法处理后红斑直径的变化（单位：mm）1号位（空白对照）2号位（马铃薯片）3号位（马铃薯软膏）4号位（消炎止痛膏）A小鼠B小鼠C小鼠D小鼠E小鼠均值方差7.4不同配比的马铃薯软膏消炎作用的比较7.4.1皮肤炎症程度的判断表5花生四稀酸点刺30分钟后红斑直径（单位：mm）甲小鼠乙小鼠丙小鼠丁小鼠戊小鼠a位b位c位d位结果统计分析：比较红斑直径的均值，分析同一只小鼠四个部位的红斑直径是否存在差异；五只小鼠之间是否存在差异。7.4.2不同配比的马铃薯软膏处理后的红斑直径在前一实验确定的疗效最显著的时间点，以四种不同配比的软膏处理红肿部位，记录29处理后五只小鼠各四个部位的红斑直径（表6）。表6马铃薯软膏处理后红斑直径（单位：mm）甲小鼠乙小鼠丙小鼠丁小鼠戊小鼠a位b位c位d位注：a、b、c、d号位分别敷1～4号软膏。计算马铃薯软膏处理后与处理前红斑直径的差值（见表7），以F检验进行统计分析各处理组间是否存在显著差异。表7不同配比的软膏处理后红斑直径的变化（单位：mm）a位（1号软膏）b位（2号软膏）c位（3号软膏）d位（4号软膏）甲小鼠乙小鼠丙小鼠丁小鼠戊小鼠均值方差8注意事项维生素B1在碱性溶液中容易分解变质。酸碱度在3.5时可耐100℃高温，酸碱大于5时易失效。遇光和热效价下降。故应置于遮光，凉处保存，不宜久贮。在酸性溶液中很稳定，在碱性溶液中不稳定，易被氧