细胞冻存方法及步骤

冻存细胞注意事项：购买的细胞经过传代后，实验时一般要求先冻存起来一些细胞（一次全部用掉有些太浪费），冻存的细胞除了能够重复试验外，还能作为备用细胞，是实验室的一种资源。为了最大限度保存细胞活力，冻存细胞的时候要慢冻。由于甘油或二甲基亚砜（DMSO）能提高细胞膜对水的通透性，不仅可使细胞内的水分渗出细胞，还能减少细胞内形成得冰晶损伤细胞，所以冻存细胞常用他们做保护剂。冻存细胞的时候需要对细胞做一定的处理，那么处理细胞时应该注意哪些事项呢？冻存细胞注意事项：1、冻存细胞前12~24h，换新鲜培养基，使细胞一直处于对数生长期。2、待细胞长至80%汇合时胰酶消化，用新鲜培养基吹打后制成细胞悬液，1000rpm离心10min。悬浮细胞则直接离心。3、弃上清，加入冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL。将细胞悬液分至冻存管内，每管1~1.5mL，拧紧盖子。在管壁上做好标记，标明细胞名称、冻存日期等。（冻存细胞液配方可为胎牛血清：培养基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培养基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根据各实验室实际条件调整）4、按下列顺序依次降温：室温→4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜→液氮保存。也可使用程序降温盒更为方便，细胞冻存管放入程序降温盒内可直接放入-80℃过夜，再转至液氮罐内。注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于最低刻度线；冻存5次后异丙醇需要跟换一次，以免影响冻存效果。5、冻存细胞后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存。