骨保护素对破骨细胞的影响程度分析

骨保护素对破骨细胞的影响程度分析[摘要]目的通过分析比较不同浓度的骨保护素（osteoprotegerin，OPG）对破骨细胞（osteoclasts，OC）活性的影响程度来研究2者在生理活性及生理功能之间的相关性。方法本次实验应用6周龄的雌性小鼠模型，添加不同浓度的骨保护素后通过抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistantacidphosphatase，TRAP）染色、细胞骨架F-actin染色及骨吸收陷窝的检测，观察OPG与OC之间的相关性。结果OC培养1h内即贴壁生长，并为展开且无大的多核OC存在。培养至第5天，较小的单核细胞逐渐开始相互融合，形成多核细胞且特征明显。OPG处理3d后，对照组细胞形态整体性良好，利用观察比较。随着OPG浓度的增大，实验组的多核细胞数逐渐减少，多核细胞数随着骨保护素（OPG）浓度的逐渐增加而减少，2者间呈现负相关的关系（r=0.516，P＜0.05）。且当骨保护素（OPG）浓度为50μg/L时，视野内仅存在少量多核细胞，模糊可见。培养结束后，OPG组多核细胞数随着OPG浓度的增大而逐渐减少，且OPG浓度为50ng/mL时仅有少量多核细胞可见；OPG的浓度为20、50μg/L时，OPG组的OC数较对照组显著减少（P0.05），而当OPG的浓度为100μg/L时，OPG组的OC数较对照组呈极显著减少（P0.01）；OPG实验组的骨吸收陷窝的面积、密度和减弱程度均与OPG的浓度呈正相关（r=0.459，P0.05），且面积比较具有显著性差异（P0.05）。结论不同浓度的OPG对破骨细胞的影响程度不同，且OPG的浓度越大其抑制性越强。[关键词]骨保护素；破骨细胞；吸收陷窝[中图分类号]R3[文献标识码]AAnalysisoftheinfluencedegreeofosteoprotegerinonosteoclastsLIUJian1，SONGHui2(1.Departmentoforthopedics,ShandongHospitalofShenglioilfieldinDongyingCity,Dongying257000,China.2.Departmentoforalandmaxillofacialsurgery,ShandongUniversityJinan250000，China.)[Abstract]:ObjectiveEffectsofdifferentconcentrationsofOPG(osteoprotegerin,OPG)onosteoclasts(osteoclasts,OC)thedegreeofinfluenceactivity,provideatheoreticalbasisforfurtherresearchOPGandphysiologicalfunctionsofOC.Methods6-week-oldfemalemicewereculturedinvitroonthebasisofaddingdifferentlevelsofOPG,byTRAPstaining,F-actincytoskeletonstainingandresorptioncorrelationdetectionnestwasobservedbetweenOPGandOC.ResultsOCculturethatisadherentgrowthwithin1h,andforthelaunchofalargemulti-coreandnoCOpresent.Culturedfor5days,thesmallermonocytesgraduallybegantofusionwitheachothertoformmultinucleatedcellsanddistinctivecharacteristics.OPGtreatmentafter3d,cellmorphologycontrolgroupoverallgooduseofobservationandcomparison.WithOPGconcentrationincreases,thenumberofcellsintheexperimentalgroupmulticoregraduallyreducethenumberofcellswithincreasingmulticoreosteoprotegerin(OPG)concentrationdecreased,showinganegativecorrelationbetweenthetworelationships（r=0.516，P＜0.05）.Andwhenosteoprotegerin(OPG)concentrationof50ng·mL-1,thereisonlyasmallamountofmultinucleatedcellswithinthefieldofvision,blurredvisible.Afterobservingtheculture,OPGGrouppolynuclearcellswithOPGconcentrationincreasesgraduallyreduced,andOPGconcentrationof50ng·mL-1isonlyafewmultinucleatedcellsvisible;concentrationofOPGwas20,50μg·L-1when,OCnumberOPGgroupsignificantlydecreasedsignificantlyreduced[OCthanthecontrolgroup,istheresultofcomparingwhattimeandunderwhattimecome?](P0.05),andwhentheconcentrationofOPGwas100μg·L-1时,OCnumberOPGgroupthaninthecontrolgroupshowedsignificantreduction[andwhocompare?](P001.);ByX2testandSpearmanrankcorrelationanalysis,theexperimentalgroupOPGboneresorptionlacunaearea,densityanddecreasethedegreeofconcentrationofOPGwerepositivelycorrelated,andtheareawasasignificantdifference(X2=15.119,r=0.459,P0.05).ConclusionEffectsofdifferentconcentrationsofOPGOPGobservedforOCformationandactivation,canprovideatheoreticalbasisforfurtherstudyofOPGandphysiologicalfunctionsofOC.[Keywords]:osteoprotegerin(OPG);osteoclasts(OC);Resorptionpits破骨细胞（osteoclasts，OC）来源于特定的破骨前体（osteoclastprecursors，OCPs），在骨吸收功能中维持至骨代谢平衡，且与全身或局部性的骨质疏松密切相关[1]。研究表明[2]，骨营养不良的最主要原因为骨吸收程度大于骨在建程度，这也间接说明了破骨细胞对骨质的影响相对较大。此外，OC活性的异常变化可对机体骨骼产生不同程度的病理性变化，如骨质疏松等。近些年发现[3]OPG可以通过OPG/RANK/RANKL机制抑制OC的分化、活化成熟并诱导OC的凋亡，且有望成为治疗多种骨代谢疾病的理想药物。但当前国内外对于骨保护素与破骨细胞之间的活化影响成对的报道较少，且其中关于活化和生成的机理尚不明确。故本试验通过对不同浓度的骨保护素对破骨细胞的生成和活化程度的影响来研究2者在生理活性及生理功能之间的相关性。1材料与方法1.1主要实验仪器与试剂超净工作台（北京精密仪器厂）；PS-9000705超纯水装置（美国LABCONCO公司）；CO2温培养箱（Heraeus公司）；倒置相差显微镜（Olympus公司：IX7000）；扫描电子显微镜（日电，JEOLJSM-T300）。抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistantacidphosphatase，TRAP）染色试剂盒购自美国Sigma公司；α-MEM（Gibco）；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司）；1600锯式切片机（Leica）、12、48孔培养板（兴万Corning）；牛皮质骨片片（直径50μm，IDS）；骨保护素（PeproTechInc.USA）。1.2OC分离与培养OC分离在参考付应宵[4]的分离方法上做出一定的改进。本实验选取6周龄的雌性ICR小鼠，使其脱颈窒息而死，将小鼠的前肢肱骨及后肢长骨在无菌环境下进行分割分离，取骨髓细胞并于200g/min下离心5min，取沉淀物。重悬于含α-MEM的培养液中（含2mmol/LL-谷氨酰胺，10%FBS、100IU/mL青霉素、100mg/L链霉素），按操作规程要求将其分别接种于12孔培养板和48孔培养板，其中在48孔板中部分放置牛骨片，同时在5%CO2饱和湿度下的环境下培养24h。贴壁细胞用37℃含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液反复冲洗，继续培养，每天更新培养液。如此反复操作3天。第4天，其中对照组加入0μg/L的OPG，实验组加入10、20、50和100μg/L的OPG，按上述条件继续培养3天后，进行检测。1.3染色处理经骨保护素（OPG）处理3天后，将细胞培养板取出，用含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，然后以4%多聚甲醛固定10min，使用TRAP试剂盒进行检测。将玻片取出，用枸橼酸/Acetone溶液进行固定后进行染色，使其在37℃的环境下孵育60min，清洗、晾干、封片，倒置显微镜观察。培养结束后，取出细胞培养板，再次以含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，4%多聚甲醛固定10min，含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，0.1%tritonX-100透膜处理5min，含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，1%牛血清白蛋白封闭30min。严格按照说明书用Phalloidin-TRITC（50mg/L）进行染色，在37℃的环境温度下避光孵育20min，含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液反复冲洗，荧光显微镜观察。1.4牛皮质骨片吸收陷窝检测将牛皮质骨片加入48孔培养板中，与细胞共同培养8天。将玻片取出，以含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，用0.25mol/L的NH3·H2O溶液超声清洗3次，每次5min，保证其可以将吸收陷窝被完全暴露出来。细胞被完全清除后，乙醇梯度脱水，丙酮置换，CO2临界点干燥，离子喷镀仪喷镀镀金。扫描电子显微镜观察。1.5统计学方法采用SPSS17.0统计学软件进行实验数据分析，正态计量数据用“sx”表示，正态资料组间比较采用t检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析，样本率的比较采用卡方检验；以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1OC形态学观察OC培养1h内即贴壁生长，为展开且无大的多核CO存在。培养至第5d，较小的单核细胞逐渐开始相互融合，形成多核细胞且特征明显。OPG处理3d后，对照组细胞形态整体性良好，利用观察比较。随着OPG浓度的增大，实验组的多核细胞数逐渐减少，多核细胞数随着骨保护素（OPG）浓度的逐渐增加而减少，2者间呈现负相关的关系（r=0.516，P＜0.05）。且当骨保护素（OPG）浓度为50μg/L时，视野内仅存在少量多核细胞，模糊可见。2.2OC染色结果培养结束后，将玻片取出，严格按照试剂盒所述步骤进行T