过氧化物酶同工酶电泳分析(经典有用)

过氧化物酶同工酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。（3）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH6.7，下层分离胶为pH8.9。HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI=6.0）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系：V=I/S。所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。过氧化物酶同工酶的鉴定原理同工酶是来自同一生物不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构，能够催化相同反应的蛋白质。同工酶作为基因编码的产物，由于模板作用，酶蛋白质中多肽链上的氨基酸顺序（通过RNA）直接反应了DNA链上碱基对的顺序，其变化能代表DNA分子水平上的变化，所以同工酶分析可解释为是从蛋白质分子水平上研究生物群体遗传分化的有效手段。在生物中酶的表达直接受遗传基因的控制，酶经聚丙烯酰胺凝胶的浓缩、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离。从小麦幼苗中提取的粗酶液电泳后，进行酶的特异染色，不同的酶组分显示在凝胶的不同位置而呈现生物特有的同工酶酶谱。仪器试剂1．实验材料称取小麦幼苗叶片1g，放入研钵内，加pH8.0样品提取液2mL，于冰水浴中研成匀浆，然后以4mL提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000r/min离心10min，倒出上清液，以等量40％蔗糖及1/5体积溴酚蓝指示剂混和，留作点样用。同上操作，再备一份其根部的样品液。2．仪器（1）垂直板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等）（2）稳压稳流直流电泳仪（3）烧杯：250mL×3（4）移液器（5）微量进样器（100μL）（6）大培养皿一套（7）漏斗3.试剂1.2％琼脂：2g琼脂，100mLpH8.9分离胶缓冲液浸泡，用前加热溶化。2.分离胶缓冲液(pH8.9Tris-HCl缓冲液)：取48mL1mol/LHCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100mL。3、浓缩胶缓冲液(pH6.7Tris-HCl缓冲液)：取48mL1mol/LHCl，Tris5.98g，用无离子水溶解后定容至100mL。4、分离胶丙胶贮液(Acr-Bis贮液Ⅱ)：Acr28.0g，Bis0.735g，用无离子水溶解后定容至100mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4℃保存。5、浓缩胶丙胶贮液(Acr-Bis贮液Ⅰ)：Acr10g，Bis2.5g，用无离子水溶解后定容至100mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4℃保存。6、过硫酸铵溶液：1g过硫酸铵溶于100mL无离子水中(当天配制)。7、电极缓冲液(pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液)：Tris6g，甘氨酸28.8g，溶于无离子水后定容至1000mL，用时稀释10倍。8、pH4.7乙酸缓冲液：乙酸钠70.52g，溶于500mL蒸馏水中再加36mL冰乙酸，蒸馏水定容至1000mL。9、联大茴香胺染色液：联大茴香胺250mg溶于140mL95％乙醇中，加20mL蒸馏水，使用前加3％过氧化氢4～5mL（当天配制）10、四甲基乙二胺（TEMED）：原液。实验步骤1、电泳槽的安装将两块玻璃板（勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作）正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃板。安装好电泳槽用pH8.9缓冲液配制的2％琼脂溶液封底，待琼脂凝固后即可灌制凝胶。2、凝胶的制备按下表所示配制分离胶贮液号24156名称分离胶缓冲液分离丙胶H2OTEMED过硫酸铵用量（ml）1.32.76.00.0400.7在小烧杯中混匀后，立即灌胶，灌胶时，将电泳槽略微倾斜，用于扶稳，将小烧杯尖端抵在长玻璃片顶端中央某点，小心估倒入两玻璃片之间，灌至距短玻璃片顶端2厘米左右即可，放平电泳槽，立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖约2~3毫米厚的水层；灌注水层时要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，影响结果，刚加水时，可看出界面，后逐渐消失，等到再出现界面时，表明分离胶已聚合，再静置一会儿，便可将水倒出，可用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，然后准备灌注浓缩胶。按下表所示配制浓缩胶贮液号35156名称浓缩胶缓冲液浓缩丙胶H2OTEMED过硫酸铵用量（ml）0.51.02.20.0150.3配制均匀后，立即灌胶，操作同分离胶的灌注，当胶面达到距短玻璃片?0.5?厘米左右即可，然后立即插入样品槽模板（梳子）。聚合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，然后小心拨出梳子，准备点样。3、点样用微量进样品小心吸取样品液加到样品槽内。上样量：叶片样液和根部样液均以梯度上样：分别为5ul、15ul、30ul4、电泳接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。打开电源开关，调节电流，初始时控制在15mA左右，当前沿进入分离胶后，可调节电流到30mA左右，待前沿指示染料下行至距胶板末端1~2厘米处，即可停止电泳。5、剥胶、染色及记录结果垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地将凝胶置于大培养皿中，进行染色反应（样品槽可以去掉）。过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，能使联大茴香发生颜色反应，产生褐色的化合物，所以用联大茴香胺染色液浸泡过的凝胶板上，有过氧化物酶同工酶蛋白质带的部位可以看到褐色的谱带。染色过程如下：（1）向大培养皿中倒入约50mlpH4.7乙酸缓冲液，将胶板淹没，室温浸泡10分钟。（2）用漏斗回收乙酸缓冲液，加入联大茴香胺染色液，将胶板淹没，室温下浸泡20分钟，在此期间会出现过氧化物酶同工酶的谱带，观察记录酶谱。