过表达miR-32削弱多氯联苯抑制P19细胞向心肌细胞的分化

中国组织工程研究第20卷第23期2016–06–03出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJune3,2016Vol.20,No.23P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·张松雨，男，1982年生，河南省南阳市人，硕士，副主任医师，主要从事心内科、心肌细胞方面的研究。中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)23-03464-06稿件接受：2016-05-03过表达miR-32削弱多氯联苯抑制P19细胞向心肌细胞的分化张松雨，李燕，刘江波，李纲(郑州大学附属南阳医院，南阳市中心医院心内科，河南省南阳市473009)引用本文：张松雨，李燕，刘江波，李纲.过表达miR-32削弱多氯联苯抑制P19细胞向心肌细胞的分化[J].中国组织工程研究，2016，20(23):3464-3469.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.018ORCID:0000-0002-2933-7606(张松雨)文章快速阅读：文题释义：多氯联苯：别名氯化联苯。多氯联苯按氯原子数或氯的百分含量分别加以标号，中国习惯上按联苯上被氯取代的个数(不论其取代位置)将多氯联苯分为三氯联苯(PCB3)、四氯联苯(PCB4)、五氯联苯(PCB5)、六氯联苯(PCB6)、七氯联苯(PCB7)、八氯联苯(PCB8)、九氯联苯(PCB9)、十氯联苯(PCB10)。多氯联苯属于致癌物质，容易累积在脂肪组织，造成脑部、皮肤及内脏的疾病，并影响神经、生殖及免疫系统，可通过对早期心脏发育相关重要基因的表达影响心肌分化进程。P19细胞：加拿大渥太华大学的McBurney等在1982年从C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中分离得到，是一种能够在体外培养的多能干细胞，P19细胞团经维甲酸诱导可分化成神经元、胶质细胞和纤维母细胞；而经二甲基亚砜诱导则分化成心肌细胞。P19细胞模型已被广泛用来研究细胞分化的分子机制。摘要背景：多氯联苯对P19细胞分化成心肌细胞有抑制作用。miRNAs在多氯联苯抑制P19细胞分化成心肌细胞过程中发挥了重要的作用。目的：探索miR-32在调节多氯联苯对P19细胞分化成心肌细胞中的作用。方法：将P19细胞与1%二甲基亚砜和2.5μmol/L多氯联苯共孵育，通过Westernblot鉴定分化标志物α-actinin、desmin、cTnI以及早期心脏发育的重要转录因子GATA4的变化。qRT-PCR鉴定多氯联苯对miR-32表达的影响。应用基因重组技术成功构建了小鼠miR-32真核表达载体，将其转染至P19细胞，与2.5μmol/L多氯联苯和1%二甲基亚砜共孵育，通过Westernblot实验观察分化相关蛋白表达。结果与结论：①多氯联苯降低了miR-32的表达水平，抑制P19细胞向心肌细胞的分化；②成功构建了小鼠miR-32真核表达载体，建立了稳定过表达miR-32的P19细胞系；③过表达miR-32发挥了削弱多氯联苯对P19细胞向心肌细胞分化的抑制作用。关键词：干细胞；分化；多氯联苯；miR-32；P19细胞；心肌细胞；过表达主题词：微RNAs；多氯联苯化合物；肌细胞,心脏；细胞分化；组织工程过表达miR-32可削弱多氯联苯抑制P19细胞向心肌细胞的分化P19细胞向心肌分化的过程中加入PCB77Westernblot法检测心肌分化标志物Westernblot法检测心肌分化标志物过表达miR-32可以削弱多氯联苯对P19细胞向心肌细胞分化的抑制作用对比倒置显微镜观察miR-32是否成功转染P19细胞高表达miR-32的P19细胞向心肌分化的过程中加入PCB77张松雨，等.过表达miR-32削弱多氯联苯抑制P19细胞向心肌细胞的分化ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH3465(DepartmentofCardiology,AffiliatedNanyangHospitalofZhengzhouUniversity,Nanyang473009,HenanProvince,China)AbstractBACKGROUND:PolychlorinatedbiphenylsinhibitthedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytes.Inthemeanwhile,microRNAsplayanimportantroleinregulatingcelldifferentiation.OBJECTIVE:ToexploretheeffectofmicroRNA-32(miR-32)onthepolychlorinatedbiphenyls-inhibiteddifferentiationofP19cellsintocardiomyocytes.METHODS:P19cellswereco-culturedwith2.5μmol/Lpolychlorinatedbiphenylsand1%dimethylsulfoxide.Afterwards,α-actinin,desmin,cTnIandGATA4wereidentifiedbywesternblotassay.WddwxrofpolychlorinatedbiphenylsontheexpressionofmiR-32wasevaluatedbyreal-timePCR.MouseeukaryoticvectorexpressingmiR-32wasconstructedbygenerecombinationtechnology,andtransfectedintoP19cellsfollowedbyco-culturedwith2.5μmol/Lpolychlorinatedbiphenylsand1%dimethylsulfoxide.Then,expressionsofdifferentiation-relatedproteinsweredetectedbywesternblotassay.RESULTSANDCONCLUSION:PolychlorinatedbiphenylsinhibitedthedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytesanddecreasedthemiR-32expression.CelllinesoverexpressingmiR-32wassuccessfullyestablishedinmice.Furthermore,wefoundthatoverexpressionofmiR-32weakenstheinhibitionofpolychlorinatedbiphenylstothedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytes.Subjectheadings:MicroRNAs;PolychlorinatedBiphenyls;Myocytes,Cardiac;CellDifferentiation;TissueEngineeringCitethisarticle:ZhangSY,LiY,LiuJB,LiG.OverexpressionofmicroRNA-32weakenstheinhibitionofpolychlorinatedbiphenylstothedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytes.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(23):3464-3469.0引言IntroductionmicroRNAs(miRNAs)是一类小分子非编码单链RNA，长约22个核苷酸，通过与靶mRNA3’非翻译区(3’-UTR)部分或完全配对，引起mRNA降解或抑制其翻译过程，从而在转录后水平对生物体内基因时序性表达起到精细调节作用[1-4]。研究表明，miRNA可调控人类60%以上的基因[5]。miRNA广泛存在于动物、植物细胞中，参与到细胞生长、分化、生物发育以及疾病发生等多种生物学过程中[1，6]。研究表明miRNA与心脏发育、心肌细胞分化、心脏疾病的发生等过程密切相关[7-9]。多氯联苯(PCBs)是一类人工合成的有机物，在工业上有超过半个世纪的应用历史，也是著名的持久性有机污染物[10]。大量研究表明暴露在多氯联苯中可导致心血管疾病发病率和严重性的增加。住在多氯联苯污染地区的人群，冠心病和急性心肌梗死的发病率增加[11]。王薛洁等[12]研究发现，多氯联苯暴露下，斑马鱼的胚胎心脏出现不同程度的发育异常。血液中多氯联苯的浓度越高，高血压的发病率越高[13]。多氯联苯可导致鱼、鸟和哺乳动物的胚胎出现心血管结构改变和功能缺陷[14]，但是多氯联苯诱导心血管疾病发生的分子机制还不清楚。P19细胞是由Rogers和Mcburney取自C3H/He小鼠诱导的畸胎癌细胞[15]，它具有自我复制和多向分化能力，是一种能够在体外培养的多能干细胞。P19细胞在维生素A酸诱导下可分化成神经元和神经胶质样细胞，在二甲基亚砜诱导下能够分化为心肌细胞[16]，该细胞模型已被广泛用来研究细胞分化的分子机制[17-18]。P19细胞易于培养，在体外可迅速大量扩增，是研究哺乳动物心脏发育、基因调控的有用工具。miR-32与多种人类恶性肿瘤的发病机制有关。Zhang等[19]研究发现过表达miR-32显著抑制SGC‑7901胃癌细胞的增殖，降低细胞的迁移能力。Petillo等[20]研究表明过表达miR-32可导致肾癌患者预后不良。Xu等[21]研究表明miR-32可以负调控Sox9的表达，从而抑制骨肉瘤细胞的增殖。Wu等[22]研究发现过表达miR-32可以通过抑制PTEN的表达而促进直肠癌细胞的增殖和迁移，减少细胞凋亡。这些研究表明miR-32可以作为致癌基因或抑癌基因从而发挥作用。实验应用基因重组技术构建小鼠miR-32真核表达载体，研究过表达miR-32及多氯联苯暴露下P19细胞分化功能，为先天性心脏病的防治提供新的线索和理论依据。张松雨，等.过表达miR-32削弱多氯联苯抑制P19细胞向心肌细胞的分化P.O.Box10002,Shenyang110180设计细胞分子生物学体外实验。1.2时间及地点实验于2014年12月至2016年2月在南阳市中心医院病理学实验室完成。1.3材料P19细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)；α-MEM培养基、胎牛血清、青/链霉素购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜、3，3，4，4-四氯联苯(PCB77)购自美国Sigma公司；嘌呤霉素、miRNA抽提试剂盒、miRNA反转录试剂盒购自Ambion公司；TaqmanMicroRNAReal-timePCR试剂盒购自美国GeneCopoeia公司；慢病毒转染增强液(polybrene)购自上海吉玛公司；ABI7500RealtimePC