肝糖原的提取、鉴定与定量-实验报告-第四实验室

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：2015级护理本科组别：第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量实验日期2016-12-20实验地点第四实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。2、了解离心管和分光光度计使用的原理并掌握操作步骤。3、熟悉吸量管、可调式微量移液器的操作步骤。4、熟悉溶液的转移操作；熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。5、了解呈色反应。二、实验原理(一)肝糖原的提取与鉴定1.糖原的分离采用研磨匀浆使细胞破碎，用低浓度的三氯醋酸使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶从而使其沉淀，而糖原仍稳定保持在上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故用95%乙醇溶液将糖原沉淀，再用热水溶解。2.糖原的鉴定(1)糖原螺旋链吸附碘分子：糖原水溶液呈乳样光泽，其长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子，呈现出红棕色。(2)呈色反应——利用葡萄糖的还原性：CuSO4+2NaOH=NaSO4+Cu(OH)2↓2Cu(OH)2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O2CuOH=Cu2O↓(红色)+H2O④Cu(OH)2=CuO↓（黑色）+H2O（二）肝糖原定量测定1.糠醛衍生物的生成及其性质糖原的水解产物葡萄糖可以在浓硫酸的作用下生成糠醛衍生物-5-羟甲基呋喃甲醛，其可以和蒽酮生成蓝色的化合物，该物质在620nm处有最大吸收。2.标准对照法进行定量糖含量在10μg～100μg，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比，利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。三、材料与方法：（一）肝糖原的提取与鉴定1.实验材料：（1）样品：鸡肝（2）试剂：5%三氯乙酸溶液、95％乙醇溶液、蒸馏水、浓盐酸、50%氢氧（3）仪器和器材：剪刀、天平、镊子、圆纸片、研钵、试管、离心机、刻化钠溶液、班氏试剂、碘试剂2.实验流程鸡肝约1.5g，剪碎＋5%CCl3COOH1ml研磨至乳状＋5%CCl3COOH3ml研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心3分钟（4000r/min）沉淀（弃去）上清（取3ml）＋3ml95%乙醇，混匀，静置10分钟离心5分钟（4000r/min）上清（弃去）沉淀＋蒸镏水1ml沸水浴2分钟，溶解沉淀白瓷板孔穴中糖原溶液1ml度吸量管（移液管）、微量可调取液器（加样枪）、滴管、白瓷反应板、试管架、恒温水浴箱＋浓HCl5滴加碘试剂2滴加碘试剂2滴沸水浴15分钟，冷却糖原溶液2滴＋50%NaOH5滴呈色对比糖原水解液2滴糖原水解液＋班氏试剂4滴混匀沸水浴2分钟，观察变化3.实验步骤步骤操作（1）肝匀浆准备称取肝组织约1.5g，放入盛有1ml5%三氯醋酸的研钵中，将肝组织磨至乳状后，再加入5%三氯醋酸3ml，在磨成肝匀浆，4000r/min离心3min，上清液倾入另一干净离心管中。（2）提取糖原向上清液中加入等量的95%乙醇，混匀，静置10min，离心5min（4000r/min）。倾去上清液，白色沉淀为糖原。加入蒸馏水1ml，并加热使沉淀溶解，溶液呈乳样光泽。（3）糖原鉴定○1与碘反应：取碘试剂2滴于白瓷板孔穴中，加糖原溶液2滴，观察其呈色。另一孔穴只加碘试剂2滴，作呈色对比。○2糖原水解液汇总葡萄糖的鉴定：取糖原溶液1ml于小试管汇总，加浓盐酸5滴，置沸水浴中水解15min，取出冷却。用50%NaOH中和（约5滴）。另取一小试管加班氏试剂4滴，加上述糖原水解液2滴混匀，在沸水浴中（或直接在酒精灯上）加热2min，观察并记录所见（二）肝糖原定量测定1.实验材料：（1）样品：鸡肝（2）试剂：30%氢氧化钾溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液、蒽酮显色剂（3）仪器和器材：剪刀、天平、镊子、圆纸片、试管、刻度吸量管（移液2.实验流程鸡肝0.15g＋30%KOH1.5ml（用吸量管）沸水浴15分钟冷却，全部转入100ml容量瓶中加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液糖原的测定3.实验步骤见下表步骤操作(1)糖原提取在试管中加入30%KOH1.5ml，在称取0.15g肝组织放入试管中，置沸水浴中15min。取出后冷却，将管内容物全部移入100ml容量瓶，定容，摇匀。管）、微量可调取液器（加样枪）、滴管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计、100ml容量瓶(2)糖原的测定取3支试管，按下表操作：试剂（ml）空白管标准管样品管蒸馏水1.0--标准葡萄糖溶液-1.0-糖原提取液--1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5混匀，沸水浴10min，冷却。混匀，沸水浴10分钟，冷却c。在分光光度计620nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）。计算公式如下：肝糖原(g/100g肝组织)=A样品×0.05×100×100×1.11A标准肝组织重(g)1000（三）注意事项1.肝糖原的提取与鉴定：（1）肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的95％乙醇后，务必注意混匀。由于最终混合液比较多，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。（2）糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下，吸附碘后呈现红棕色。（3）糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。（4）离心时，一定要注意对称，质量配平，若听到离心机声音过大，应立即停止离心。2.肝糖原定量测定（1）肝组织必须定量，精确，因为要涉及到后期的计算。（2）肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则影响比色。（3）注意定量转移，取量务必准确。（4）蒽酮含有浓硫酸，转移需用刻度吸量管。（5）若肝糖原含量小于1%，须改用间接测量法，即肝组织消化后，用95%乙醇沉淀糖原。四、实验现象：（一）肝糖原的提取与鉴定1.肝匀浆离心3min后（在取了上清液后才拍照，导致上清液看起来有点浑浊）图1肝匀浆离心3min后的分层现象2.取3ml上清液向其中加入3ml95％乙醇后，溶液呈淡黄色图2加入乙醇后的上清液3.鸡肝上清液经乙醇处理，离心后可看到少量白色沉淀物（表明有一定的糖原含量）4.在白瓷板孔穴中，2滴糖原溶液滴加2滴碘液后，对比2滴碘液加2滴蒸馏水，有变化，有红棕色物质生成，说明有糖原生成，现象如下图：图3呈色对比5.糖原溶液加入班氏试剂后呈清蓝色,水浴2min,颜色变化,但未出现砖红色沉淀2滴糖原溶液+2滴碘液2滴碘液+2滴蒸馏水图4左边是水浴之前右边是水浴之后（二）肝糖原定量测定1.0.15g鸡肝加入KOH溶液再水浴15min,拿出后溶液呈现浅棕红色图5鸡肝中加入KOH溶液并沸水浴后现象2.将鸡肝溶解液移入容量瓶，加蒸馏水至刻度线混匀后，溶液呈浅米黄色。3.三支试管，从左边到右边依次是空白管，标准管和样品管，并且都加有2.5ml的蒽酮溶液。加入蒽酮溶液时，试管迅速温度升高，液体上层有蒸腾的现象。配置空白管、标准管、样品管时，溶液均有放热现象。图6加蒽酮试剂的糖原溶液水浴后颜色图六左边数起第一支试管是空白对照（蒸馏水+0.2%蒽酮溶液）的结果，溶液呈黄色（稀释后的蒽酮溶液的颜色）；左边数起第二支试管是标准葡萄糖溶液+0.2%蒽酮溶液的结果，溶液为绿色（黄色加蓝色的结果）；左边数起第三支试管是糖原提取液+0.2%蒽酮溶液的结果，溶液为黄色，与空白对照的结果颜色相近。五．结果与讨论（一）实验数据处理1、在肝糖原定量测定中，所取鸡肝组织为0.15g。2、3支试管在620nm波长处的吸光度（取平均值）3、按照实验原理中给出的公式，计算鸡肝组织中肝糖原的含量：肝糖原(g/100g肝组织)=A样品×0.05×100×100×1.11A标准肝组织重(g)1000代入数据有：肝糖原(g/100g肝组织)=0.037×0.05×100×100×1.110.6200.151000即待测肝中，每100g组织中肝糖原含量为0.221g/100g肝组织。测定次数各管吸光值A620空白管标准管样品管100.6200.043200.6210.037300.6200.032各管平均值A—62000.6200.037（二）结果讨论1.肝糖原的提取与鉴定（1）鸡肝上清液经乙醇处理，离心后可看到极少量白色沉淀结论：存在微量糖原。（2）在加入碘试剂进行呈色对比时，可观察：加入碘试剂后的糖原溶液，颜色发生变化，呈现红棕色，比碘液本身的颜色深，但是变化不明显结论：存在微量糖原。（3）在利用班氏试剂鉴定糖原水解液中葡萄糖时，加入班氏试剂的糖原水解液呈现浅蓝色，水浴后，颜色发生变化，但是没有出现预期的砖红色沉淀，反而蓝色更浅了。结论：未出现砖红色沉淀，说明没有葡萄糖，间接说明没有糖原。分析（1）（2）（3）的原因：鸡肝样品的质量较少，导致所含的肝糖原较少；对比本实验室其他组的实验结果，同样没有出现砖红色沉淀，可能的原因有：实验室所用的鸡肝不是新鲜的鸡肝，而是保存了一段时间，导致肝糖原因此而减少；在进行沸水浴的过程中，经常打开锅盖造成温度降低，达不到一定温度。2.肝糖原的定量（1）结果：该样品中肝糖原含量为每100g肝组织含肝糖原0.221g。（2）结论：查书可得饱食鸡肝肝糖原含量为2～3g/100g肝组织。在本组实验中测得肝糖原数值小于正常范围值，未达到预期的实验结果。但对比本实验室其他组别，所求值同样偏小，可见鸡肝组织本身含肝糖原很少。