除草剂阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞微核和总核异常的影响[J]

ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ除草剂阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞微核和总核异常的影响孟顺龙，胡庚东，瞿建宏，吴伟，陈家长*中国水产科学研究院淡水渔业研究中心//中国水产科学研究院内陆渔业生态环境和资源重点开放实验室，江苏无锡214081摘要：采用静态水质接触染毒法将鲫鱼（Carassiusauratus）分别暴露于质量浓度为0、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0mg·L-1的阿特拉津溶液中，分别在染毒后的第3、6、10、14、19和24d对所有染毒组鲫鱼进行尾静脉采血；研究在不同作用时间和不同质量浓度下，阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞微核和总核异常的影响。结果表明：阿特拉津能使鲫鱼外周血红细胞微核率和总核异常率显著升高，并在一定条件下存在剂量-效应和时间-效应关系。短时间（≤6d）暴露时，阿特拉津与外周血红细胞微核率之间在0~10.0mg·L-1范围内存在剂量-效应关系；长时间（≥10d）暴露时，仅在0.1~5.0mg·L-1范围内存在剂量-效应关系。而阿特拉津与外周血红细胞总核异常率之间则在所有测定时间下均存在剂量-效应关系。同时，时间-效应的研究结果表明，在所有质量浓度下，鲫鱼外周血红细胞微核率和总核异常率均随着污染胁迫时间的延长而先升高后降低，且外周血红细胞微核率和总核异常率达到峰值所需时间表现为低质量浓度的滞后于高质量浓度的。试验显示，除草剂阿特拉津对鲫鱼具有潜在的致突变作用，其能对鲫鱼产生较强的遗传损伤，且遗传损伤程度随阿特拉津质量浓度的增加或污染胁迫时间的延长而增强。关键词：阿特拉津；鲫鱼（Carassiusauratus）；亚急性；微核；核异常中图分类号：X171.5文献标识码：A文章编号：1672-2175（2008）01-0178-06微核试验由Heddle[1]和Schmid[2]于20世纪70年代分别独立创建，是检测污染物对机体细胞遗传损伤程度的一个重要指标和检测化学物质毒性的一种常规方法[3]。微核试验与染色体畸变实验有良好的相关性[4]。由于微核检测具有方法简便、观察容易、结果可靠等优点，目前一些国家和地区已将其规定为新药、化妆品、食品添加剂等物质的毒理安全性评价的必做实验[5-7]。阿特拉津又名莠去津，化学名为2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪,分子式为C8H14ClN5，是我国目前广泛使用的一种旱地除草剂，其能通过地表径流、淋溶、干/湿沉降等方式进入水体，从而对水生生态环境和人类饮用水源造成潜在的污染。近年来，因其使用量大、残留期长、环境水体中检出率高[8]和具有内分泌干扰作用等而受到广泛的关注[9]。但目前有关阿特拉津对生物毒理效应的研究主要集中在哺乳动物的鼠类[10]和两栖动物的蛙类[11]，且结论不一。有关阿特拉津对水生生物的毒理效应，特别是对水生生物遗传毒性的研究则鲜见报道。为此，本试验以鲫鱼（Carassiusauratus）为供试生物，研究了阿特拉津对其外周血红细胞微核和总核异常的影响。旨在为有关部门制订该除草剂的合理使用规章提供一定参考；为分析评价阿特拉津对鱼类的生态安全性提供相应的毒理学资料；同时也为我国淡水渔业资源和水生态系统的保护提供一些科学依据。1材料与方法1.1试验鱼类试验鱼类为鲫鱼（Carassiusauratus），取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心实验场，体长为14.28±0.78cm，体质量为65.99±4.75g(n=24)。试验前将鲫鱼在实验室条件下驯养两周，每天定时投饵一次，并用电磁式空气压缩机进行充氧。光暗比为14h∶10h。驯养期间没有出现自然死鱼现象。选择活动性强的健康鲫鱼进行试验。1.2试验用水试验用水为曝气一周的去氯自来水，水温20±1℃，溶解氧6.5~7.0mg/L，pH7.0~7.5，水质指标符合渔业水质标准（GB11607-89）。1.3仪器和试剂注射器；针头；载玻片；染缸等。120U·mL-1肝素钠生理盐水液；pH为7.4的磷酸盐缓冲液；M-G染液；1:1M-G磷酸盐缓冲液（即1体积M-G染液与1体积磷酸盐缓冲液混合而成）；体积分数为10%的Giemsa液（将Giemsa原液用pH=7.4的磷酸盐缓冲液稀释而成）；甲醇（分析纯）；w=48%阿特拉津可湿性粉剂（由常州农林药业有限公司生产）。1.4染毒采用静态水质接触染毒法对鲫鱼染毒。先根据文献[12]进行阿特拉津对鲫鱼的96h急性毒性试验，得到96hLC50值为105.94mg·L-1。为保证试验期间药物对鱼类的安全性，阿特拉津的试验质量浓度范围设在1/10的96hLC50之内，具体质量浓度ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ为：0、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0mg·L-1。每个质量浓度设一个平行组。在体积为250L的水族箱中分别配制上述各质量浓度的试验液150L，每个水族箱中随机放入鲫鱼50尾。试验期间每天换水50%，并补足受试物至原有质量浓度，每2天定时投饵一次。其余条件与驯养期间相同。分别在染毒后的第3、6、10、14、19和24天对所有质量浓度组鲫鱼进行尾静脉采血，观察不同作用时间和不同质量浓度下阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞微核和总核异常的影响。1.5采血制片及镜检计数取样时从每组2个平行样中各随机抽取试验鱼3条，共6条。先用纱布擦干鱼体表面后，再用注射器（为防止血液凝固，吸取少量质量浓度为120U·mL-1的肝素钠液润湿针头及注射器内壁）从尾静脉抽取少量血液，滴入干净的载玻片上，按常规方法制成血涂片并晾干。之后，用甲醇固定15min；晾干后转移到盛有体积分数为10%的Giemsa染液的染缸中，染色15min；取出后立即用pH=7.4的磷酸缓冲液冲洗，晾干后即可用于镜检计数。每尾鱼制片3张，分别选择其中最好的一片用于镜检。将6次镜检结果的平均值作为最终结果。将血涂片置于油镜（10×100）下观察、计数，每张片子计数5000个红细胞。分别记录微核和核异常细胞数，结果以千分率（‰）表示。其中微核为圆形或椭圆形，直径为主核的1/5~1/4左右；核异常包括小核、双核、无核、核质外凸、核质内凹、核质断裂、核位置明显异常等[13]。计算公式如下：cmmNNR；caaNNR；Rt=Rm+Ra其中，Nc为每张片子观察的细胞数；Nm为所观察细胞中具有微核的细胞数；Na为所观察细胞中具有核异常的细胞数（不含微核细胞数）；Rm为微核细胞率；Ra为核异常细胞率；Rt为总核异常细胞率。1.6数据处理应用单因素方差分析和LSD法对数据进行多重比较（只作染毒组与对照组之间的比较）。采用回归方法分析阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞微核和核异常的影响的剂量-效应和时间-效应关系，以相关系数（R）表示相关程度，并用t检验法进行相关显著性检验。P0.05为差异（或相关）显著，P0.01为差异（或相关）极显著。2结果与分析在不同作用时间和不同质量浓度下，阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞微核和总核异常影响的试验结果分别如图1和图2所示。由图1和图2可见，在正常情况下（对照组），鲫鱼外周血红细胞微核率和总核异常率都比较低，且空白组在不同作用时间下的红细胞微核率和总核异常率差异都不显著（P0.05）。但经阿特拉津作用后，红细胞微核率和总核异常率均开始升高，并图2不同质量浓度、不同作用时间下阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞总核异常率的影响Fig.2Effectsofatrazineontotalfrequencyofnucleusanomaliesoferythrocyteincrucianwithdifferentexposureconcentrationsandeffecttime注：图2中的“*”和“**”分别表示与对照组相比差异显著(p0.05)和极显著(P0.01).图1不同质量浓度、不同作用时间下阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞微核率的影响Fig.1Effectsofatrazineonmicronucleusfrequencyoferythrocyteincrucianwithdifferentexposureconcentrationsandeffecttime注：图1中的“*”和“**”分别表示与对照组相比差异显著(p0.05)和极显著(P0.01).*************************************************00.511.522.533.5对照0.10.51.05.010.0阿特拉津浓度/(mg•L-1)红细胞微核率/‰3d6d10d14d19d24d*************************************************00.511.522.533.5对照0.10.51.05.010.0阿特拉津浓度/(mg•L-1)红细胞微核率/‰3d6d10d14d19d24dｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ在一定条件下达到显著或极显著水平。这充分说明用微核试验来检测阿特拉津对鲫鱼的遗传损伤是可行的。2.1阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞微核的影响如图1所示，从鲫鱼外周血红细胞微核率的变化来看，当作用时间较短（≤6d）时，在本试验所设质量浓度范围内，随着染毒质量浓度的增加鲫鱼外周血红细胞微核率逐渐上升，说明阿特拉津质量浓度和红细胞微核率之间存在着剂量-效应关系。以阿特拉津质量浓度为横坐标，红细胞微核率的上升率为纵坐标，分别对第3和第6天的剂量-效应关系做线性回归分析，分别得回归方程：y=55.173x+38.825（R=0.989）和y=86.493x+161.12（R=0.966），经t检验，两回归方程式的相关系数均达到极显著水平（P0.01）。当作用时间较长（≥10d）时，红细胞微核率仅在0.1~5.0mg·L-1范围内随着阿特拉津质量浓度的升高而增加；当阿特拉津质量浓度大于5.0mg·L-1时，红细胞微核率反而下降。以阿特拉津质量浓度为横坐标，红细胞微核率的上升率为纵坐标，在0.1~5.0mg·L-1阿特拉津质量浓度范围内分别对第10、14、19和24天的剂量-效应关系做回归分析，分别得回归方程：y=216.240Lnx+564.23（R=0.960）、y=111.790Lnx+499.85（R=0.996）、y=77.945Lnx+308.83（R=0.996）和y=93.235Lnx+293.60（R=0.978）；经t检验，第10天和第24天的剂量-效应关系均达到显著水平（P0.05），第14天和第19天的均达到极显著水平（P0.01）。从阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞微核率影响的时间-效应来看，各染毒质量浓度下的红细胞微核率均随着阿特拉津胁迫时间的延长而表现出先升高后降低的变化趋势。但染毒质量浓度不同时，红细胞微核率达到峰值的时间有所差异；具体表现为：低质量浓度（0.1~0.5mg·L-1）条件下达到峰值所需时间长，为14d；中间质量浓度（1.0~5.0mg·L-1）时达到峰值所需时间较短，为10d；高质量浓度（10.0mg·L-1）时达到峰值所需时间最短，仅为6d。以阿特拉津作用时间为横坐标，红细胞微核率的上升率为纵坐标，分别对0.1mg·L-1和0.5mg·L-1质量浓度组在3~14d范围内的时间-效应关系做线性回归分析，分别得回归方程：y=22.696x-72.174（R=0.994）和y=30.692x+32.428（R=0.997），经t检验，两回归方程式的相关系数均达到极显著水平（P0.01）；以阿特拉津作用时间为横坐标，红细胞微核率的上升率为纵坐标，分别对1.0mg·L-1和5.0mg·L-1质量浓度组在3~10d范围内的时间-效应关系做线性回归分析，分别得回归方程：y=62.871x-27.576（R=0.997）和y=90.802x+73.695（R=0.988），经t检验，1.0mg·L-1质量浓度组回归方程的相关系数达到显著水平（P0.05）。2.2阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞总核异常的影响如图2所示，阿特拉津对鲫鱼外周血红细胞总核异常率的影响与对外周血红细胞微核率的影响在变化趋势上很相似