遗传标记STR基因座的高分辨电泳分型

遗传标记STR基因座的高分辨电泳分型姓名摘要：STR（ShortTandemRepeat，短片段重复序列）广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，一般由2～6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列。人群中这些重复序列具有多态性，通过对这种多态性的检测可以进行STR分型。本实验首先通过磁珠法提取人类基因组DNA，之后对3个STR基因座进行PCR扩增，然后用聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）对PCR产物进行分离，最后PCR产物用EB染色后在紫外灯下观察实验结果并对此进行分析。通过此次实验，我们掌握了遗传标记STR基因座的高分辨电泳分型的实验原理、实验操作和实验结果的观察分析，取得了良好的实验效果。关键词：STR、磁珠法、PCR扩增、聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）1．引言DNA指纹技术的发展经历了三代。第一代DNA指纹技术利用了DNA指纹图谱。1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为“DNA指纹”，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。众多“DNA指纹”组成“DNA指纹图谱”。第二代DNA指纹技术用PCR的方法对STR位点进行PCR扩增可得到不同长度DNA片段，用银染或荧光的方法对扩增后的DNA片段检测得到DNA指纹。第三代DNA指纹技术是用PCR的方法对SNP位点进行PCR扩增。STR（ShortTandemRepeat，短片段重复序列）广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性。它们一般由2～6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，重复次数大多在10～60次之间，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。对于一个特定的个体，染色体上某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一位置处的重复次数可能不同，这就构成了人群中这些重复序列的多态性。由于人类基因组中这种重复序列非常多，通过对这种多态性的检测，就可以明确区分个体与个体的不同，确定父母子的亲缘关系，这就是STR分型。由于STR具有分布广泛均匀、多态性丰富、信息量大、检测简便等优点，被认为是继限制性片段长度多态性（RFLP）之后的第二代遗传标记，已广泛应用于遗传图谱绘制、基因定位、法医鉴定、遗传病诊断等诸多领域。目前已经有DNA分型图谱。联合应用16个STR位点，其个体识别率可达0.999999999998。联合应用16个STR位点，其父权排除率可达0.99998。本次实验中人类基因组DNA的提取使用磁珠法核酸纯化技术。它采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。该方法快速简捷，一般可在36分钟内完成。不用多次漂洗磁珠也可确保基因组DNA的高纯度，提取出的基因组DNAOD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达20kb～50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外核酸扩增技术，由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（简称TEMED）和催化剂过硫酸铵（简称AP）或核黄素（C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE），用于分离蛋白质和寡核苷酸。核酸经过染色才能显示带型，最常用的是溴化乙锭染色法。溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外线激发下，发出红色荧光。激发荧光的能量来源于两个方面，一是核酸吸收波长为260nm的紫外线后能将能量传送给溴化乙锭，二是结合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波长为300nm和360nm的紫外线的能量，来源于这两方面的能量，最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光，发射波长为605nm。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍，因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。此次实验首先通过磁珠法提取人类基因组DNA，之后对3个STR基因座进行PCR扩增，然后用聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）对PCR产物进行分离，最后将PCR产物用EB染色，在紫外灯下观察实验结果并对此进行分析。2．材料和方法2.1材料、试剂和器材实验材料：人类口腔上皮细胞实验试剂：饮用水或自来水、BufferMACL、BufferMCL、ProteinaseK、BufferMA、MagicMagBeads、70%乙醇、TE(pH8.0)、碎冰、ddH2O、10×PCR缓冲液（含MgCl2）、2.5mmol/LdNTP、10μmol/L引物（D1S1677-F、D1S1677-R、D4S2364-F、D4S2364-R、D10S1248-F、D10S1248-R）、1U/μlTaq酶溶液、、1%琼脂（糖）、10×TBE、30%聚丙烯、APS、TEMED、电极缓冲液、6×loadingbuffer、20bpDNALadder、溴化乙锭（EB）实验仪器：10mL离心管、1.5mL离心管、台式高速离心机、微量移液器、蓝枪头、黄枪头、白枪头、恒温水浴锅、磁力架、PCR管、PCR仪、marker笔、贮槽、螺丝销钉、长玻璃板、短玻璃板、“凵”形硅橡胶框、细长头的滴管、电泳仪、紫外灯凝胶成像仪2.2方法2.2.1磁珠法提取人类基因组DNA（1）漱口。用10mL饮用水或自来水持续用力漱口，之后将其收集于10mL离心管中，2000rpm离心5min，将上清液小心用微量移液器吸除，沉淀为收集得到的口腔脱落细胞。（2）裂解。向细胞沉淀中加入400μLBufferMACL，200μLBufferMCL和20μLProteinaseK，用微量移液器反复吸打，均匀悬浮起细胞沉淀。然后将其转移至1.5mL离心管中。65℃水浴20～30min。12000rpm离心5～10min，小心取出500μL上清至新的离心管中。（3）结合。向样品中加入400μLBufferMA和10μLMagicMagBeads。剧烈颠倒震荡混匀10s。在加入MagicMagBeads之前，要将MagicMagBeads充分颠倒混匀。务必将MagicMagBeads加至液面以下，并尽量将枪头上残留的MagicMagBeads吸打干净。震荡后如管口沾有少量beads，用微量移液器吸取上清液并将其冲洗至离心管内。（4）磁吸附。将离心管至于磁力架上2min，待MagicMagBeads全部吸至离心管壁上，用微量移液器吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管。吸弃上清时尽量吸净，但要避免吸入Beads。（5）洗涤。加入700μL70%乙醇，颠倒震荡混匀10s。震荡后如管口沾有少量beads，用微量移液器吸取上清液并将其冲洗至离心管内。将离心管置于磁力架上1min，待MagicMagBeads全部吸至离心管壁上后，用微量移液器吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管。吸弃上清时尽量吸净，但要避免吸入Beads。（6）重复步骤（5）一次。（7）干燥。干燥前应尽量吸净上清，若出现液体挂壁现象，可将离心管短暂离心后，再次将其至于磁力架上1min，待MagicMagBeads全部吸至离心管壁上，用微量移液器吸净上清，然后从磁力架上取出离心管。室温开盖干燥15min（或者放入37℃的温箱中，放入时间不得超过5min）。（8）洗脱。加入20μLTE(pH8.0)，用枪头吸打混匀，将管壁上所有Beads都悬浮于TE溶液中。65℃水浴10min，间或摇匀，使DNA充分洗脱。（9）取出离心管，短暂离心，置于磁力架上1min，用微量移液器小心吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。2.2.2PCR扩增人类的3个STR基因座片段（1）取3个PCR管，冰上操作，按照表一的加样顺序和加样量，构建3个样品反应体系。每个样品反应体系均为25μL。表一PCR反应体系的构建加样顺序成分体积（μL）1ddH2O16210×PCR缓冲液（含MgCl2）2.532.5mmol/LdNTP1410μmol/L引物11510μmol/L引物2161U/μlTaq酶溶液0.57DNA样品3合计25（2）以上成分加好后，盖上PCR管管盖，在管壁和管盖上做好标记。将PCR管稍稍离心集液于管底，之后进行PCR反应。（3）按照表二中所示的PCR反应中各项目所需的温度和时间进行PCR反应。表二PCR各项目所需的温度和时间项目温度时间预变性94℃11min变性94℃1min复性59.4℃1min延伸72℃2min终延伸60℃30min保存10℃∞2.2.3用聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）对3个STR基因座PCR产物进行分离（1）安装夹心式垂直板电泳槽。①装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。②将长、短玻璃板分别插到“凵”形硅橡胶框的凹形槽中，勿用手接触灌胶面的玻璃。③将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。④将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。⑤竖直电泳槽。在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂（糖）。1循环35次凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。（2）制胶。配制36mL8%的PAGE凝胶，其标准配方如表三所示。表三8%的PAGE凝胶标准配方成分体积ddH2O22.8mL10×TBE3.6mL30%聚丙烯9.6mLAPS200µLTEMED40µL（3）制备1mm凝胶板。将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，距短玻璃上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。约30～60min凝胶完全聚合。加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。（4）样品的处理及加样。向PCR后得到的样品中加入5µL6×loadingbuffer，混匀后取7µL加入到点样孔中。另外还要向点样孔中加入DNAmarker，即20bpDNALadder。（5）电泳与DNA分离①开启电泳仪电源。②选择合适的电压（180V）和时间（90min）。③将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连。④启动电泳，待观察到负极有气泡升起方可离开。⑤电泳结束，关闭电源，取出凝胶。⑥EB染色10min。⑦凝胶成像仪成像，观察电泳结果，摄片，保存，分析。3．结果（1）此次实验对人类基因组中3个STR基因座片段进行PCR扩增和分离，用到3组相应的引物。这3个STR基因座片段的相关遗传学参数如表四所示。表四3个STR基因座片段相关遗传学参数基因座染色体定位核心序列引物名称PCR产物大小（bp）等位基因基因型在中国人群中的杂合性（H0）D1S1677chr1(GGAA)nD1S1677-FD1S1677-R81～1177120．6609D4S2364chr4(GAAT)n(GGAT)n(GAAT)nD4S2364-FD4S2364-R67～835100．7478D10S1248chr10(GGAA)nD10S1248-FD10S1248-R83～1238160．7652①本次实验选取这3个STR基因座片段的原因是其在中国人群中的杂合性（H0）较高，即较多人具有这3个STR基因座片段，从而最终得到实验结果的可能性较大。②这3个STR基因座片段分别在人类第1对、第4对、第10对染色体上，即均在常染色体上，与性别无关。③这3个STR基因座片段PCR