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纤维素乙醇的生产与未来——酿酒酵母对复合抑制剂响应机理的蛋白素学分析SACCHAROMYCESCEREVISIAEPROTEOMEANALYSISOFCOMPOSITEINHIBITORRESPONSEMECHANISM2013级生物信息朱紫阳纤维素乙醇（LIGNO-CELLULOSICBIO-ETHANOL）纤维素生物质是由纤维素（30-50%），半纤维素（20-40%），和木质素（15-30%）组成的复杂材料。纤维质生物质中的糖以纤维素和半纤维素的形式存在。纤维素中的六碳糖和和玉米淀粉中含有的葡萄糖一样，可以用传统的酵母发酵成乙醇。而半纤维素中含有的糖主要为五碳糖，传统的酵母无法经济地将其转化为乙醇每一种植物的确切成分都不尽相同。纤维素存在于几乎所有的植物生命体中，是地球上最丰富的分子。一直以来，将纤维质生物质转化成乙醇是科学家们面对的巨大挑战。酸、高温等苛刻的条件都曾经被用来尝试将纤维素分子打断、水解成单一的糖。随着石油资源的逐渐枯竭和环境的日益恶化，大力推广使用可再生能源技术已成为许多国家能源发展战略的重要组成部分，以减少对化石能源的依赖和温室气体的排放。纤维素乙醇技术，是一种高端的清洁能源技术，因为它可以被用来替代传统的粮食乙醇技术，利用地球上广泛存在的纤维素质生物原料生产清洁的乙醇燃料，被寄予了很高的期望。酿酒酵母对复合抑制剂响应机理的分析针对纤维素乙醇发酵过程中对发酵微生物的耐受性的要求，本研究采用定量蛋白质组学的方法，对酿酒酵母在乙醇发酵过程中对复合抑制剂AFP的响应机理进行了研究分析。『在纤维素的预处理过程中，会产生乙酸，糠醛和苯酚类的化合物，这些化合物对后续的微生物发酵过程具有毒害作用，通常被称为抑制剂。』[1]吕亚金酿酒酵母对复合抑制剂耐受机理的蛋白质组学研[DB/OL],2014选题实用意义与价值酿酒酵母(SACCHAROMYCESCEREVISIAE)属于酵母菌科，是一种单细胞生物，成卵圆形或球型，繁殖方式为出芽繁殖，孢子繁殖，接合繁殖三种，形态简单但生理复杂，工业上用于酿酒。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10ΜM。酿酒酵母生物科学类用途Etc…从酿酒酵母中提取质粒提取生产核酸类衍生物、辅酶A、细胞色素C、谷胱甘肽和多种氨基酸的原料可制成酵母片模式生物酵母菌作为该实验对象的优势：1.酵母菌能够在基本培养基上生长,使得实验者能够通过改变环境控制其生长；2.通过连锁分析、定位克隆然后测序验证而获得的人类遗传性疾病相关基因的研究中，后者的核苷酸序列与酵母基因的同源性为其功能研究提供了极好的线索。酵母也为高等真核生物提供了一个可以检测的实验系统。例如，可利用异源基因与酵母基因的功能互补以确证基因的功能。利用异源基因与酵母基因的功能，还能使酵母成为其它生物新基因的筛查工具。通过使用特定的酵母基因突变株，对人类cDNA表达文库进行筛选，从而获得互补的克隆。3.酵母菌的生命周期短,适合经典的遗传学分析,使得在酵母菌16条染色体上构建精细的遗传图谱成为可能.·材料试剂和蛋白质组学实验方法1:材料：酿酒酵母基因突变菌株及亲代菌株BY4742-Δgir2BY4742-Δtae2，BY4742-Δysp2，BY4742培养基：2：a.细胞前处理:取菌液离心，离心条件为：4°C，8000r/min，5min。弃去上清，留细胞沉淀。用PBS缓冲液洗细胞1~2次：向细胞沉淀中加入PBS溶液，涡旋振荡混匀，离心。离心条件为：4°C，8000r/min，5min。弃去上清，留细胞沉淀.b.蛋白质提取：细胞沉淀磨成细粉状后离心，加入1ml裂解液后摇匀，超声破碎后加入10μLDNaseI/RNaseA酶混合溶液，涡旋振荡混匀后，，将样品于4°C冰箱放置20min。向各样品中分别加入10μL苯甲基磺酰氯（PMSF）溶液，涡旋振荡混匀后，将样品于4°C冰箱放置2h，并于放置过程中不时混匀。将样品离心，取上清。蛋白质浓度的测定C.采用Bradford法，考马斯亮蓝试剂，微孔板测定法来测定提取出的胞内蛋白质溶液浓度。1.从冰箱中取出考马斯亮蓝染液，混匀，将染液在室温条件下放置约0.5h，使染液平衡至室温；预热酶标仪20min。2.用蒸馏水将5x考马斯亮蓝染液稀释至1x浓度，将稀释后的考马斯亮蓝染液混匀。3.标准曲线的测定。取一块酶标板，按表2-3加入所需试剂。标准曲线的每个点进行三次平行测定，保证测量的准确性和平行性。4.向酶标板中加入各组分后，震荡混匀，室温放置5～10min使考马斯亮蓝染液与BSA标准品充分反应。5.用酶标仪测定各个浓度的标准溶液在595nm处的吸光度，以不含BSA的考马斯亮蓝染液的吸光度作为参比。6.以蛋白质浓度和对应的吸光度分别为横坐标和纵坐标作图，添加线性回归趋势线，得到标准曲线回归方程（图2-1）7.取5μL样品，加入495μL的1x考马斯亮蓝染液，震荡混匀后，室温放置5～10min使考马斯亮蓝染液与蛋白质样品充分反应。用酶标仪测定各样品溶液在595nm处的吸光度，以不含BSA的考马斯亮蓝染液作为参比。根据样品吸光度，对照标准曲线得到样品中蛋白质浓度。每个样品点进行三次平行测定，且注意样品的加入量，使样品的吸光度位于标准曲线的线性范围内。有机试剂沉淀蛋白质在线二维液相色谱与串联质谱检测通过质谱检测和谱图处理，得到储存肽段碎片信息的mgf格式文件，通过Mascot软件在NCBI蛋白质数据库中搜索，得到蛋白质鉴定结果图文分析总结结果与分析对于C0，C1，C2和C3的四代酿酒酵母细胞，我们分别比较了细胞内的蛋白质的表达水平在延滞期和对数期的差异以C0代的细胞中某蛋白质的表达量作为参比，分析该蛋白质在复合抑制剂条件下培养的三代酿酒酵母细胞中的表达量调节。其中，下调倍数低于0.8的蛋白质，和上调倍数高于1.25的蛋白质被视为差异表达的蛋白质。P1.表达蛋白功能差异分析每个代谢途径类别的pvalue值如表中所示。各代谢途径的pvalue值，代表此类代谢途径在所有代谢途径类别中的显著性水平，此pvalue值越小，说明此代谢途径相关的蛋白质表达水平的调节，对酿酒酵母对复合抑制剂耐受能力的影响越大。从图3-1中可以看出，差异表达的蛋白质几乎覆盖了酿酒酵母的所有代谢途径的大类，其中，从蛋白层面分析，调整最显著的蛋白质的功能集中在，碳代谢，能量代谢，蛋白质合成，以及细胞抗逆性能等方面。压力响应相关的蛋白质的调控（1）延滞期压力响应相关的蛋白质的调控（2）对数生长期根据差异表达的蛋白质的功能分类分析结果，对于酿酒酵母细胞对复合抑制剂AFP压力的响应，我们关注与“Cellrescue,defense,andvirulence”功能相关的差异表达的蛋白质。如上图1，2所示，我们在Expander软件中采用K-均值聚类分析的方法，分别分析了延滞期和对数期的具有“Cellrescue,defenseandvirulence”功能的差异表达的蛋白质的表达水平调控，在K-均值聚类分析中，延滞期的和对数期的此类功能的差异表达的蛋白质分别按照其表达量的调控被分为两组。此外，图1，2中显示了这些蛋白质的具体表达水平，各个蛋白质对应的基因名和系统名如图1，2中所列。根据上图1，2的聚类分析结果可以看出，此类差异表达的蛋白质的表达水平差异，不仅存在于无抑制剂环境下的C0代细胞与抑制剂环境下的C1，C2，C3代酿酒酵母细胞之中，也存在于抑制剂环境下的三代酿酒酵母细胞C1，C2和C3相互之中。同时还涉及能量代谢调控的结果分析、、表达量上调（下调）的蛋白质分析、酿酒酵母细胞对复合抑制剂AFP的响应机理、酿酒酵母细胞对复合抑制剂AFP的细胞记忆分析等等….这些实验将在今后的研究过程中实现，还请各位在座的BOSS多做考虑，予以支持！展望1.生物能源具有广阔的应用前景。随着分子生物学和合成生物学技术的发展，采用相关的技术手段，可以改造微生物菌株来利用多种底物，生产多种生物能源。目前，在利用微生物发酵生产生物能源的相关研究领域，培养基中原有成分对发酵微生物的毒害作用，对于优化利用微生物发酵来生产生物能源的技术有着不容忽视的影响。研究发酵菌株对这些环境压力的响应机制，对于优化改造菌株，提高发酵性能有着重要意义。2.在后续研究中，可以通过驯化过程来提高细胞对特定压力的响应速率，或者引入调控因子等，来对细胞内的压力耐受相关的代谢过程进行更精确有效的调控，从而提高微生物菌株对环境压力的耐受能力，缩短发酵周期，提高发酵效率。20