酶工程复习资料

第一章绪论1.何谓酶工程，试述其主要内容和任务。酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。2.酶有哪些显著的催化特性？酶是生物催化剂，与非酶催化剂相比，具有专一性强、催化效率高和作用条件温和等显著特点。3.简述影响酶催化作用的主要因素。酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。5.简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。酶活力单位：在特定条件下（温度可采用25℃，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（kat）酶活力的测定方法：振荡测定法，酶柱测定法，连续测定法，固定化酶的比活力测定，酶结合效率与酶活力回收率的测定，相对酶活力的测定。或者测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法其它.酶的发展历史：4000多年前的夏禹时代——酿酒技术。3000多年前的周朝——制造饴糖、食酱等食品。1833年——佩恩和帕索兹从麦芽的水抽提物中得到淀粉酶。19世纪中叶——巴斯德对酵母的乙醇发酵进行研究。1913年——米彻利斯和曼吞根据中间产物学说，推导出米氏方程。1926年——萨姆纳得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质。1960年——雅各和莫诺德提出操纵子学说。1982年——切克发现核酸类酶。1983年——阿尔特曼发现核糖核酸酶P的RNA部分M1RNA具有核糖核酸酶P的催化活性。酶的专一性分为绝对专一性和相对专一性。相对专一性又可分为键专一性和基团专一性米氏方程：酶的可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。Km增大不变减小Vm不变减小减小酶的生产方法：提取分离法，生物合成法，化学合成法第二章经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动获得所需要的酶的技术过程，称为酶的发酵生产。酶的发酵生产是当今产酶的主要方法，因为微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点。1.试述酶生物合成的基本过程。a．RNA的生物合成——转录：转录的起始、RNA链的延伸、转录的终止、RNA前体加工成为成熟的RNA分子。b．蛋白质的生物合成——翻译：氨基酸活化生成氨酰-tRNA、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止、蛋白质前体加工修饰成具有特定空间结构的功能蛋白。2.何谓酶生物合成的诱导作用？是简述其原理。加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用。原理：当无诱导物存在时，调节基因产生的阻遏蛋白与操纵基因结合，覆盖RNA聚合酶的结合部位，RNA聚合酶无法与启动基因结合，结构基因无法转录，酶合成受受阻。当诱导物存在时，其与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生改变而降低与操纵基因的结合能力，RNA聚合酶与启动基因结合，结构基因正常转录，相应酶得以表达。3.什么是酶生物合成的反馈阻遏作用？试简述其原理。酶生物合成反馈阻遏作用指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使酶的生物合成受到阻遏。原理：无阻遏物存在时，调节基因产物阻遏蛋白无法与操纵基因结合，结构基因正常转录，相应酶得以正常表达。当阻遏物存在时，其与阻遏蛋白结合使之空间构象发生改变，阻遏蛋白与操纵基因结合，抑制RNA聚合酶与启动基因的结合，下游结构基因转录受阻，酶无法正常表达。4.简述分解代谢的阻遏作用的原理及解除方法。分解代谢阻遏之所产生，是因为细胞内某些物质经分解代谢产生ATP，ATP则是由ADP和AMP经磷酸化转变而来，ATP合成，即意味着胞内ADP、AMP浓度下降，cAMP通过水解作用以补充胞内AMP浓度，故胞内cAMP浓度下降。同时腺苷酸环化酶活性降低，cAMP合成受阻，致使胞内cAMP浓度进一步降低。故而cAMP-CAP复合物浓度随之降低，启动基因特定部位无足够cAMP-CAP复合物与之结合从而抑制了RNA聚合酶与启动基因的结合，结构基因无法表达，酶合成受阻。解除方法：在培养环境中控制某种易降解物质的量，或在必要时添加适量的cAMP。5.酶的生物合成有哪几种模式？同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型。6、如何控制微生物发酵产酶的工艺条件？a．保藏的菌种用于生产之前要通过细胞活化使细胞的生命活力得以恢复；b.根据不同细胞和不同用途的不同要求配置各营养组分适宜的培养基；c.根据不同菌种、不同产物、不同工艺条件等不同情况调节培养基pH、温度、溶解氧量使之处于适宜状态。7．提高酶产量的措施主要有哪些？添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂、添加产酶促进剂。10.简述固定化微生物细胞发酵产酶的特点？提高产酶；可以反复使用或连续使用较长时间；基因工程菌的质粒稳定、不易丢失；发酵稳定性好；缩短发酵周期，提高设备利用率；产品容易分离纯化；适于胞外酶等胞外产物的生产。11.固定化微生物原生质体发酵产酶有何特点？变胞内产物为胞外产物；提高产酶率；稳定性较好；易于分离纯化。第三章动植物细胞培养产酶2，何为抗体酶？试述获得抗体酶的主要方法。答：抗体酶又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。1）半抗原诱导法。以预先设计的过渡态类似物作为半抗原，与载体蛋白（如牛血清蛋白）偶联制成抗原，然后免疫动物，再经过单克隆抗体制备技术制备，分离，筛选得到所需的抗体酶。2）酶蛋白诱导法。是以某种酶蛋白作为抗原诱导抗体酶产生的方法。首先选定一种酶蛋白作为抗原来免疫某种动物，在酶蛋白抗原的诱导下，动物体内产生与酶分子特异结合的抗体；再将获得的酶抗体来免疫该动物，并采用单克隆抗体制备技术制备得到与酶抗体特异结合的抗抗体。那么抗抗体结合部位的构象与用作抗原的酶分子的结合中心的构象相同。对抗抗体进行筛选，就有可能获得具有催化活性的抗体酶。3，植物细胞培养产酶有何特点？答：1）产率高。2）生产周期（与完整植株相比较）短，一般为15~30天。3）易于管理，减轻劳动强度。4）提高产品质量。5）其他：对剪切力敏感，生产周期长，许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照。5，试述植物细胞产酶的工艺条件及其控制。答：1）温度的控制。一般为25度左右。通常不高于35度，不低于20度。2）PH的控制。一般为PH5.5~5.8。通常介于5.0~6.0的微酸性范围。3）溶解氧的调节控制。一般通过通风和搅拌来供给。不能太强烈，以免破坏细胞。4）光照的控制。根据植物细胞的特性及目标次级代谢物的种类不同，进行光照的调控。5）前体的添加。为提高次级代谢物产量在培养过程中添加目的代谢物的前体。6）刺激剂的应用。促使植物细胞的物质代谢朝着生成某些次级代谢物的方向进行，强化次级代谢物的生物合成，提高某些次级代谢物的产率。6，动物细胞培养过程中要注意控制哪些工艺条件？答：1）温度。一般在36.5度，允许波动范围在0.25度之内。2）PH。一般在PH7.4条件下生长最好，通常在7.0~7.6的微碱性范围内。3)渗透压。一般在700~850kPa范围内。4)溶解氧。一般通过调节进入反应器的混合气体的量及其比例调控溶解氧。混合气体由空气，氧气，氮气，二氧化碳四种气体组成。二氧化碳兼有调节供氧和调节PH的双重作用。7，举例说明动物细胞产酶的工艺过程。答：以生产组织纤溶酶原活化剂为例：1）配制人黑色素瘤细胞培养基。2）人黑色素瘤细胞培养：A将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理，细胞分散后，用PH4.7的磷酸缓冲液洗涤，计数，稀释成细胞悬浮液；B在消毒好的反应器中装进一定量的培养液，将上述细胞悬浮液接种至反应器中，接种浓度为1000~3000个细胞/ml，于37度的CO2培养箱中，通入含5%CO2的无菌空气，培养至长成单层致密细胞；C倾去培养液，用PH7.4的磷酸缓冲液洗涤细胞2~3次；D换入一定量的无血清Eagle培养液，继续培养；E每隔3~4天，取出培养液进行tPA（组织纤溶酶原活化剂）的分离纯化；F再向反应器中加入新鲜的无血清Eagle培养液，继续培养，以获得大量tPA。3）组织纤溶酶原活化剂的分离纯化。在获得的上述培养液中加入一定量的蛋白酶抑制剂和表面活性剂，过滤去沉淀，适当稀释后，采用亲和层系技术进行分离，得到tPA溶液。经过浓缩，葡聚糖G-150凝胶层次，冷冻干燥，得到精制tPA干粉。第四章1细胞破碎的方法：机械破碎法通过机械运动产生剪切力，使组织细胞破碎物理破碎法通过各种物理因素，使组织细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎化学~通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞破碎酶促~通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，从而达到细胞破碎2.酶提取主要方法：盐溶液提取酸~碱~有机溶剂提取3酶沉淀分离方法的原理P-91表4-3特点：盐析法主要用于蛋白类酶的分离纯化，盐析时，温度一般维持室温，对温度敏感的酶应低温条件，溶液的PH应调到欲分离的酶等电点附近等电点主要用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。加酸或加碱的过程中，要一边搅拌一边慢慢加，以防局部过酸或过碱，引起酶变性失活。有机溶剂分离效果受溶液PH的影响。该方法比盐析法洗出的沉淀易于离心或过滤分离，不含无极盐，分辨率也高，但容易引起酶变性失活，所以必须在低温条件下操作，而且沉淀析出后要尽快分离，减少有机溶剂对酶的影响复合`~复合沉淀剂与酶形成复合物，溶解度降低选择性~对酶没有明显影响4膜分离技术借助一定孔径的高分子膜，将不同大小不同形状不同特征的物质颗粒或分子进行分离的技术称为~应用超滤蛋白质除盐浓缩及分离纯化反渗透海水淡化电场膜分离：脱盐海水淡化纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸，谷氨酸及凝胶电洗脱。5超临界萃取又称超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中溶解度不同而达到分离的一种萃取技术特点P-129双水相萃取利用溶质在两个互不相溶的水相中溶解度不同而达到分离特点P-128影响因素第3段6离子交换层析利用离子交换剂的可解离集团对各种离子的亲和力不同而达到分离目的一种层析分离方法。要点离子交换剂的选择处理装柱上柱洗脱和收集再生亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的可逆亲和力，使生物分子分离纯化的技术控制好温度PH等条件，以免酶失活母体和配基的偶联结合凝胶层析利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术操作要点制备胶时，防止气泡产生，为此将各种所需比例的贮存液混合以后，应该抽气处理2洗脱液体积一般为凝胶床体积的120%3上柱体积为凝胶床10%，不得超过30%凝胶的选择与处理装柱上柱洗脱7连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用相同的PH和相同的缓冲液不连续凝胶电泳：采用2或3层性质不同的凝胶重叠起来使用，采用2中不同的PH和不同缓冲液，能使浓度较低的各种组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率梯度连续凝胶电泳：采用自上而下浓度逐渐升高，孔径逐渐减小的梯度凝胶电泳。主要测定球类蛋白质的分子质量SDS-凝胶电泳巯基乙醇能使蛋白质分子中二硫键还原，SDS能使蛋白质分子的请柬，疏水键打开，并与蛋白质分子结合。为此，蛋白质—SDS复合物迁移速率不再受蛋白质原有电荷及分子形状影响，只取决于蛋白质相对分子质量。8酶结晶方法盐析~有机溶剂~透析平衡~等电点~温度差~金属离子复合~9技术：细胞破碎提取细心分离过滤与膜分离沉淀分离层析分离电泳分离萃取分离浓缩干燥结晶第五章——酶的分子修饰1，试述酶分子修饰的概念和作用答：概念：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变从而改变酶的催化活性的技术过程。作用：酶的分子结构发生某些合理改变有可能提高酶的催化效率，增加酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性，改变酶的底物专一性。同时在酶学和酶工程研究方面具有重要的意义。2，何谓金属离子置换修饰？简述其主要修饰过程和作用答：概念：把酶分子中的金属离子换成另