酶工程实验讲义最终稿.

酶工程实验Maincontents酸性磷酸酶的提取酶促反应进程曲线的制作蛋白质含量的测定酸性磷酸酯酶的酶活力测定酸性磷酸酯酶米氏常数的测定凝胶过滤层析纯化酸性磷酸酶酸性磷酸酯酶的检测—SDS-PAGE电泳法酸性磷酸酯酶固定化设计型实验实验一酸性磷酸酯酶的提取实验目的掌握胞内酶的分离提取方法。学会离心机的使用。实验原理酸性磷酸酯酶（AcidPhosphatase，ACP）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。本实验选用紫贻贝消化腺中的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。本实验所采用的是Folin-酚法。实验材料及仪器1.高速冷冻离心机：2.电子天平或托盘天平3.手术剪4.100ml烧杯5.100ml三角烧瓶6.漏斗7.纱布8.滤纸9.碾钵10.培养皿11.100ml量筒12.一次性手套13.记号笔14.紫贻贝：实验试剂0.01mol/LHAC-NaAC缓冲液结晶硫酸铵石英砂实验步骤1.紫贻贝预处理:将买来的紫贻贝用过滤的海水饥饿处理4~8小时。2.解剖：戴上手套，将紫贻贝解剖后，观察其消化腺的位置。3.匀浆：取紫贻贝消化腺，用滤纸吸干后称重，加入1倍体积预冷的缓冲液和石英砂在研钵中完全研成浆状。静置0.5h。4.离心：4℃,4000rpm/min，离心10分钟。5.保存：将离心管中大部分上清液倒入量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后倒入三角烧瓶中，做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“原酶液”计算：上清液体积（mL）粗酶液得率（mL/g）＝上清液体积/紫贻贝消化腺的重量6、将原酶液精确三等分，一份进行梯度盐析提纯；一份放于冰箱内保存，用来做凝胶过滤层析（实验六）；一份用于酶固定化实验。7.梯度盐析粗酶液+35g/100ml硫酸铵4℃，静置2h4000rpm/min离心，10min沉淀上清液+70g/100ml硫酸铵4℃，静置2h4000rpm/min离心，10min沉淀合并溶于缓冲液中8、透析：将缓冲液中的粗酶液装入透析袋中，并对同样的缓冲液充分透析。9、定容：将透析后的酶液定容，得透析后酶液，用于后续实验。实验二酶促反应进程曲线的制作实验目的学会制作酶促反应的进程曲线。掌握可见分光光度计的使用。实验原理所谓进程曲线是指酶促反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线。它表明了酶促反应随反应时间变化的情况。测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。实验器材VIS-7200型可见分光光度计数显恒温水浴锅试管试管架实验试剂酸性磷酸酯酶酶液5mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)：精确称取磷酸苯二钠(C6H6Na2PO4·2H2O，相对分子质量254.10)2.54g，加蒸馏水溶解后定容至100mL，即配成了100mmol／L磷酸苯二钠水溶液，密闭保存备用。用0.2mol／L的pH5.6的乙酸盐缓冲液稀释20倍，即得5mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)。0.2mol／L的pH5.6乙酸盐缓冲液。Folin-酚试剂1mol／L碳酸钠溶液。实验步骤管号123456789101105mmol/L磷酸苯二钠溶液各0.5ml酶液（35℃预热过的）各0.5ml，一加入就计时，注意合理安排各管的加入时间，最好先加第11管，隔1min再加第10管035℃精确反应时间（min）35710121520253040501mol/L碳酸钠溶液各5mL（用于终止反应）Folin-酚稀溶液各0.5mL0号试管加入酶液0.5mL35℃保温显色10min以上A6800管号1234567891011酶液加入时刻（min）11号试管最先加样109876543210碳酸钠加入时刻（min）1314151718202428324150具体时间控制表结果试管1234567891011A680初速度的时间范围：0～min1、画图：以反应时间为横坐标，A680为纵坐标绘制进程曲线，并将其贴在实验报告上，由进程曲线求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围(直线部分涵盖的时间)。注意事项1．酶促反应应保持温和条件，反应液要避免剧烈搅拌或震荡。2．实验前要设计好每支试管的加样顺序，确保反应时间的准确性。3．酶促反应的加样顺序不得搞错，否则无法显色。思考题1．随着反应时间的延长，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低，这是为什么？2．如果酶促反应在一个较大的体系中，如在烧杯中进行，每隔一定的时间从烧杯中取样测定该体系中产物的生成量，并绘制酶促反应进程曲线，该方法和本实验采用的方法结果会一致吗?哪个更好一些？实验三蛋白质含量的测定目的1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理2.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的操作技术原理微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。三聚氰胺（化学式：C3H6N6），俗称蜜胺、蛋白精，IUPAC命名为「1,3,5-三氨基-2,4,6-三嗪」，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶於水，可溶於甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，具毒性，不可用於食品加工或食品添加物。Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。紫外分光光度法测定蛋白质浓度由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninicacid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml；MicroBCA试剂测定范围是0.5-20μg/ml快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。基本原理：BCA蛋白质检测流程：考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。R250中的R代表Red，偏红，(C45H44N3O7S2Na).R250属于慢染，脱色脱的完全，主要用于电泳染色G250中的G就是Green，偏绿(C47H48N3O7S2Na).G250属于快染，脱色脱的不彻底，主要用于蛋白测定，比考马斯亮蓝R250多二个甲基.λmax=590―610nm.CoomassieDye-Based蛋白质定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+实验器材比色皿分光光度计移液管或枪试管实验试剂标准蛋白质溶液：准确称取牛血清清蛋白（BSA）10mg，溶于0.9%NaCl溶液100ml，即为配制成0.1mg/ml标准蛋白质溶液。考马斯亮蓝G-250染料试剂：称考马斯亮蓝G-250100mg，溶于95%乙醇溶液50ml，再加入85%磷酸100ml，用水稀释至1000ml。此溶液在室温下可放置1个月。粗酶液及透析后酶液操作方法1.标准曲线制作取6支试管，分两组按下表平行操作。摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色。以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。试管编号012345标准蛋白质溶液/ml00.20.40.60.81.00.9%NaCl溶液/ml1.00.80.60.40.20G-250试剂/ml4.0蛋白质含量/ug.mL-12.未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。注意事项1、如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。2、测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。思考题1、与其它测定蛋白质浓度的方法相比，考马斯亮蓝染色法测定有何优点？实验四酸性磷酸酯酶的酶活力测定目的及原理一、目的通过对酶促反应速度的测定，计算出酶的活力，掌握可见分光光度计的使用。二、原理请参见实验一实验器材VIS-7220型可见分光光度计HH-2型数显恒温水浴锅取样器试管20只。试管架1个实验试剂1、请详见实验三2、0.4mmol/L酚标准应用液：精确称取分析纯的酚结晶0.94g溶于0.1M的HCl溶液中，定容至1000mL，即为酚标准贮存液，贮存于冰箱可永久保存，此时的酚浓度约为0.01mol/L。临用时将上述的酚标准贮存液用蒸馏水稀释25倍，即得到0.4mmol/L酚标准应用液。实验步骤1．标准曲线的制作取试管6支，按0到5的顺序逐管编号，空白为0号。按照表，向各试管中依次加入0.4mmol／L酚标准应用液、0.2mol／L的pH5.6的乙酸盐缓冲液、1mol／L碳酸钠溶液和Folin一酚试剂，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。摇匀，在35℃保温10min以上以0号试管为空白，测定OD680nm下吸光度，以OD680为横坐标、酚标准应用液的毫升数为纵坐标作一条标准曲线。保留该数据，以便实验直接引用。以上操作总结为表2．酶活力的测定酶活力单位的定义为：在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔(μmol)产物所需要的酶量规定为一个活力单位。用1号试管的A680在标准曲线上查出其对应的酚标准应用液的毫升数V，根据公式：2×0.4×V×1000/10可计算出lmL酶液中所含有的酶的活力。3．酶活力的计算思考题如用定磷法来测定酶活力，实验应该如何设计？酶活力测定实验中，为什么即设了空白，又要设对照？实验五酸性磷酸酯酶米氏常数的测定目的掌握米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定原理和实验方法掌握可见分光光度计的使用原理测定Km和Vm，特别是测定Km，是