过量表达Bacillussubtilis磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶对大肠杆菌产琥珀酸的影响

微生物学通报MAR20,2010,37(3):325330MicrobiologyChina©2010byInstituteofMicrobiology,[e-mail]基金项目：国家973计划项目(No.2009CB724701);国家自然科学基金项目(No.20606017);江苏省“青蓝工程”项目*通讯作者：Tel:[phone];:[e-mail]收稿日期：2009-11-02;接受日期：2009-12-14研究报告过量表达Bacillussubtilis磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶对大肠杆菌产琥珀酸的影响于丽姜岷*马江锋岳方方刘树文(南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室江苏南京210009)摘要:在大肠杆菌厌氧混合酸发酵途径中,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)皆可催化由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)到草酰乙酸(OAA)的反应。鉴于经由PCK催化的反应伴有ATP的生成,理论上更有利于菌体生长和产酸,本研究以大肠杆菌W3110(△pfl,△ldh)为出发菌株,利用λ-Red同源重组系统构建了其ppc缺陷菌株并在此基础上过量表达了Bacillussubtilispck基因。初步的厌氧发酵实验表明:过量表达pck可在一定程度上恢复初始菌株厌氧代谢葡萄糖的能力。其中又以ppc缺陷株更为明显,其耗糖能力和产酸能力分别为对照菌株的4.2和15.3倍。关键词:磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,大肠杆菌,琥珀酸EffectofOverexpressionofBacillussubtilisPhosphoenolpy-ruvateCarboxykinaseonSuccinateProductioninEscherichiacoliYULiJIANGMin*MAJiang-FengYUEFang-FangLIUShu-Wen(StateKeyLaboratoryofMaterials-OrientedChemicalEngineering,CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing,Jiangsu210009,China)Abstract:Bothofthephosphoenolpyruvatecarboxylase(PPC)andphosphoenolpyruvatecarboxykinase(PCK)couldcatalyzethereactionfromphosphoenolpyruvate(PEP)tooxaloaceticacid(OAA)inthepath-waysofanaerobicmixedacidfermentationforE.coli.Inaddition,thereactioncatalyzedbyPCKgeneratesATP,whichismorebeneficialtothegrowthofthestrainandthesuccinicacidproductiontheoretically.Inthisstudy,weconstructedappcdefectivestrainusingλ-RedhomologousrecombinationsystemwiththeE.coliW3110(△pfl,△ldh)astheparentstrain.Basedonthat,Bacillussubtilispckwasoverexpressed.Thepreliminaryanaerobicfermentationexperimentsshowedthatbothstrainspartiallyrecoveredtheabilitytoconsumeglucosethroughtheoverexpressionofpck.Besides,theppcdefectivestrainshowedthemostex-cellentperformance,therateofglucoseconsumptionandsuccinateproductionwere4.2and15.3foldsasmuchasthoseoftheparentstrain,respectively.326微生物学通报2010,Vol.37,No.3:Phosphoenolpyruvatecarboxykinase,Phosphoenolpyruvatecarboxylase,E.coli,Succinicacid琥珀酸(又称丁二酸),被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业,同时,作为优秀的C4平台化合物,可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料,被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一[12]。利用微生物发酵法转化可再生资源生产琥珀酸,价格低廉、污染小,且在发酵过程中可吸收固定CO2,开辟了温室气体利用的新途径,近年来成为研究的热点。琥珀酸的生产菌株很多,目前主要集中在Anaerobiospirillumsucciniciproducens[3]、Actinobacillussuccinogenes[4]、Mannheimiasucciniciproducens[5]和重组E.coli上。其中,E.coli由于具有遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点,近年来被广泛用于研究以获得产琥珀酸优秀菌株。图1[6]显示了大肠杆菌的厌氧混合酸发酵途径。产琥珀酸大肠杆菌基因改造策略主要有:增强代谢途径中的关键酶(如PPC)、失活或敲除竞争途径中的酶(如LDH、PFL)、引入新的代谢途径(如乙醛酸循环)等[7]。图1大肠杆菌厌氧混合酸发酵途径[6]Fig.1PathwaysofanaerobicmixedacidfermentationforEscherichiacoli[6]其中,PEP羧化酶(PPC)基因(ppc)和PEP羧化激酶(PCK)基因(pck)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与草酰乙酸(OAA)之间的反应。Millard等[8]在大肠杆菌中过量表达E.colippc和pck,研究发现过量表达ppc可以使琥珀酸作为混合酸发酵的主要产物,且产量较出发菌株提高3.5倍,而过量表达pck对发酵结果没有影响,但在ppc缺陷菌株中,pck的过量表达能够提高琥珀酸的产量。因此,PPC可能是催化PEP至OAA的最主要的酶,而当ppc缺陷时,PCK可催化该反应。SanYupLee等[9]在大肠杆菌中过量表达E.colipck,结果表明当培养液中HCO3的浓度低时,细胞中的羧化反应由PPC完成,而HCO3浓度高时,主要由PCK完成该反应。向培养基中添加20g/L的NaHCO3时,重组菌的琥珀酸产量比野生菌提高了2.2倍。鉴于经由PCK催化的反应伴有能量的生成,可能有利于琥珀酸的积累及副产物乙酸量的降低,本研究以实验室自主构建的大肠杆菌W3110(△pfl,△ldh)为出发菌株,利用λ-Red同源重组系统[10],成于丽等:过量表达Bacillussubtilis磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶对大肠杆菌产琥珀酸的影响327功构建了ppc缺陷菌株W3110(△pfl,△ldh,△ppc::apra)。同时构建了Bacillussubtilispck的重组表达质粒pTrc99a-BSpck,该质粒具有耐受高浓度葡萄糖的特点。研究初步考察了过量表达PCK对重组大肠杆菌W3110(△pfl,△ldh)及W3110(△pfl,△ldh,△ppc::apra)厌氧发酵产琥珀酸的影响。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和质粒:大肠杆菌W3110(△pfl,△ldh)为本实验室自主构建并保藏,Bacillussubtilis168购自微生物菌种保藏中心,本研究中构建的其他菌株如表1所示。质粒pTrc99a、pIJ790及pIJ773由邵蔚蓝老师(南京师范大学)惠赠,如表2所示。表1本研究中构建的重组菌株Table1Recombinantstrainsconstructedinthisresearch名称Name性状CharacterYL1W3110(△pfl,△ldh,△ppc::apra)YL2W3110(△pfl,△ldh,)/pTrc99a-BSpckYL3W3110(△pfl,△ldh,△ppc::apra)/pTrc99a-BSpck1.1.2引物:扩增阿普拉霉素抗性基因的引物P1、P2分别由两部分组成。靠近5′端加下划线的序列与ppc基因两翼序列同源,靠近3′端未加下划线的序列与质粒pIJ773上阿普拉霉素抗性基因两侧序列互补。在大肠杆菌染色体上ppc基因同源重组区域外侧,设计引物P3、P4,用于检测重组菌株。扩增Bacillussubtilispck基因的引物为P5和P6,加下划线的序列分别为限制性内切酶SacI和XbaI的酶切位点。各引物的详细序列如表3所示。表2本研究中所用的质粒Table2Plasmidsusedinthisresearch名称Name大小(bp)Size(bp)抗性Resistance抗生素浓度(μg/mL)ConcentrationforE.coli(μg/mL)pIJ7906084Chloramphenicol30pIJ7731382Apramycin50pTrc99a4176Ampicillin100表3本研究中所用的引物Table3Primersusedinthisresearch名称Name序列(5′→3′)SequenceP1ATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCATTCCGGGGATCCGTCGACCP2AGCACGAGGGTTTGCAGAAGAGGAAGATTAGCCGGTATTACGCATACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCP3CAGGGCTATCAAACGATAAGATGP4AAAACGAGGGTGTTAGAACAGAAGP5CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCGP6GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG1.1.3主要试剂:基因组提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;质粒小量快速提取试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品;DNA片段回收试剂盒、限制性内切酶、PyrobestDNA聚合酶和T4DNA连接酶为大连宝生物有限公司产品;L-阿拉伯糖购自Sigma公司;酵母提取物和胰蛋白胨为Oxoid公司产品;其他试剂为国产分析纯。1.1.4培养基:有氧培养采用LB培养基;厌氧培养基为LB添加10g/L碱式碳酸镁和12g/L葡萄糖。重组菌培养时,阿普拉霉素、氯霉素和氨苄青霉素在培养基中的工作浓度分别为50、30和100μg/mL,诱导剂IPTG的终浓度为0.5mmol/L。1.2方法1.2.1PCR扩增:以质粒pIJ773为模板,P1、P2为引物,进行敲除用片段的扩增,反应条件为:94C10min;94C45s,50C45s,72C90s,10个循环;94C45s,55C45s,72C90s,15个循环。以平板筛选出的阳性单菌落为模板,P3、P4为引物,进一步采用菌落PCR鉴定,反应条件为:94C10min;94C45s,55C45s,72C100s,35个循环;72C10min。以Bacillussubtilis基因组DNA为模板,P5、P6为引物,进行pck片段的扩增,反应条件为:94C5min;94C45s,53C45s,72