葡萄糖氧化酶

葡萄糖氧化酶一、酶的简介葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase，简称GOD)能够在有氧气的条件下专一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢,高纯度GOD的制剂为淡黄色粉末、易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、甘油和乙二醇[1]。50%丙酮、66%甲醇能使其沉淀。它广泛地分布于动物、植物和微生物体内，但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源，微生物中的主要生产菌株为黑曲霉和青霉。葡萄糖氧化酶是用黑曲霉等发酵制得的一种需氧脱氢酶，对人体无毒、副作用，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功能，它广泛应用于食品、饲料、医药等行业中，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。【2】二、菌种及培养基2.1菌种：以黑曲霉H1-9b为菌种，在发酵罐中装入培养基2.2发酵培养基(g/L)：蔗糖80、蛋白胨3、KH2PO42、MgSO4·7H2O0.7、KCl0.5、NaNO34，pH5.5；斜面培养基(g/L)：蔗糖30、NaNO32、K2HPO41、KCl0.5、MgSO40.5、FeSO40.01、琼脂20，pH5.5【3】。发酵条件为：26～29摄氏度，pH值自然，通风量0．3m3／(m3·min)，搅拌速度400r／min。发酵液离心分离得菌丝体，经研磨(因葡萄糖氧化酶是一种胞内酶，提取时首先必须先研磨破壁)后过滤，得到含葡萄糖氧化酶的滤液即酶液。[4]三、工艺流程葡萄糖氧化酶制备流程图原料预处理培养基配制灭菌无菌空气制备菌种的制备和种子培养发酵产品的分离纯化葡萄糖氧化酶下游工艺流程图3.1葡萄糖氧化酶的发酵3.1.1种子液培养在斜面培养基上接种黑曲霉H1-9b孢子，28℃培养4～5d。3.1.2摇瓶发酵250mL锥形瓶中分装50mL发酵培养基，121℃灭菌20min，接种黑曲霉H1-9a孢子浓度为104个/mL，28℃、200r/min摇床培养80h即达产酶高峰。3.1.3菌丝体的制备摇瓶发酵培养完成后，用纱布过滤发酵液，收集球状菌丝体，用双蒸水将其反复冲洗，直至把发酵液冲干净；再用0.2mol/LpH5.7的磷酸缓冲液冲洗菌丝体，压干水分，称质量后收集备用[5]。3.2粗酶液的制备本实验采用研磨法破碎菌丝体。将菌丝体置于研钵中，加入适量石英砂，对菌体进行研磨；充分研磨后按1:1(m/V)加入预冷的0.2mol/LpH5.7磷酸缓冲液浸提粗酶，4℃抽提2h。抽提完成后4℃、12000r/min离心20min，取上清液，即为粗酶液，透析1d后收集备用。3.3DEAE-Sepharose离子交换层析用300mL0.05mol/LpH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose离子交换层析柱，取5mL粗酶液上样，用0～1mol/LNaCl(用0.05mol/L，pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，流速0.5mL/min，每管收集5mL，层析完成后收集GOD活性管，透析脱盐，冷冻干燥后备用[6]。3.4Superdex-200凝胶过滤层析用0.05mol/LpH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡Superdex-200凝胶过滤层析柱过夜，将冷冻干燥后的样品加水稀释至2mL上样，用0.05mol/LpH7.1的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，流速0.3mL/min，每管收集3mL，层析完成后收集GOD活性管，透析脱盐，冷冻干燥得到GOD纯品[7]。分离纯化步骤说明：分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法很多，包括沉淀法、吸附法、离子交换法、凝胶过滤和亲和色谱等方法，这里先介绍沉淀法和离子交换法。沉淀法：选择合适的沉淀剂浓度，通过分级沉淀或一步沉淀，可将葡萄糖氧化酶与其他蛋白质初步分开，此法单独使用时提纯效果较差，一般比活性只能提高一倍左右，使用价格便宜且操作简单的沉淀法和吸附法，葡萄糖氧化酶的比活性提高不大；离子交换法：提纯的葡萄糖氧化酶的比活性(一般为200—250U／mg)较沉淀法和吸附法为高，产率30％一60％。离子交换法是较为理想的方法，如AmberliteCG一50树脂对葡萄糖氧化酶具有良好的吸附性，适合于工业规模制备葡萄糖氧化酶[8]。从整个分离纯化过程看，纯化效果较好，纯化倍数较高。四、产品检测1、酶活性测定邻联茴香胺法[9]【试剂】酶：葡萄糖氧化酶浓度为1-4mg/ml缓冲液：PH6.00.1MPB底物：18％葡萄糖产物H2O2用偶联的HRP酶反应测定：HRP水溶敝，含60U／m1；1％邻联茴香胺水溶液，临用前取0．1ml、用缓冲液加至12．0ml。【方法】在25℃条件下，试验皿中加邻联茴香胺稀释液2．5ml、18％葡萄糖液0．3ml、HRP水溶液0．1ml、葡萄糖氧化酶液0．1ml，对照皿中加邻联茴香胺稀释液2．6ml、18％葡萄糖液0．3ml、HRP水溶液0．1mI。记录460nm波长处试验皿中吸光度值的变化，共2—4分钟。【计算】酶活性(U／mg)=酶活性单位以每分钟释放1mMH2O2的酶量为萄糖氧化酶活性单位。2、酶的纯度鉴定由Superdex-200凝胶过滤层析纯化的酶液经SDS-PAGE分析，用考马斯亮蓝R-250染色，呈现单一条带，说明该酶已经达到电泳纯(图3)。3、纯化结果及回收率[10]：2014年9月18日参考文献[1]赵晓芳、张宏福等,葡萄糖氧化酶的功能及在畜牧业中的应用[J],广东饲料,2007,16(1):34-35.[2]刘子宇、李平兰、郑海涛等,微生物高密度培养的研究进展[J],中国乳业,2005,12:47-51.[3]刘峰、黄鹭强、林颖等,从土壤中快速筛选葡萄糖氧化酶产生菌及发酵工艺的优化[J],生物技术,2007,17(3):64-68.[4]张茜、傅婉辉、康劲翮等,青霉葡萄糖氧化酶的分离纯化及性质研究[J],厦门大学学报:自然科学版,2009,48(1):99-102.[5]刘峰、黄鹭强、林颖等,从土壤中快速筛选葡萄糖氧化酶产生菌及发酵工艺的优化[J],生物技术,2007,17(3):64-68.[6]张龙翔、张庭芳、李令媛等,生化实验方法和技术[M].2版,北京:高等教育出版,1997:100-106.[7]张婷等,AspergilliusnigerZ-25产葡萄糖氧化酶发酵条件优化及酶的分离纯化研究[D],南京:南京农业大学,2008.[8]张茜等,尼崎青霉菌葡萄糖氧化酶的分离纯化及性质研究[D],厦门:厦门大学,2009.[9]SIMPSONC,JORDAANJ,GARDINERNS,etal.Isolation,purifica-tionandcharacterizationofanovelglucoseoxidasefromPenicilliumsp.CBS120262optimallyactiveatneutralpH[J].ProteinExpressionandPurification,2007,51(2):260-266.[10]蒋成淦等,酶免疫测定法[M].1版,北京：人民卫生出版社出版,1984:187-188