薄层色谱法实践技巧

薄层色谱法实践技巧目的：1.药典：薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与事宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。2.如果你是做鉴别的话，薄层的系统适用性主要是做检测限和分离度；3.如果你是做含量测定，比如说用薄层扫描法，薄层的系统适用性应该做线性范围、同板精密度、异板精密度、回收率；4.手工铺制的板子，只适宜于定性分析，不宜于分离定量；5.化学药一般是作有关物质，需要一定的载药量，所以要适当增加厚度；6.中药一般较难分离，需要薄板，以增加分离度；7.手工铺制的板子常用的有：硅胶G板和硅胶CMC-Na板。前者是煅石膏（石膏经140℃烘烤3—4小时）与硅胶按1—1.3：10混合均匀。每份硅胶G加水2—3份调成糊状，即可使用。后者的操作各位大虾已有论述。8.如果你铺板目的是做分析用的话，肯定得很仔细用心；如果仅是天然药化那种粗略检查过柱子得到的馏分纯度，那就没有必要这么复杂了，也就是说速度可以快点，板的要求也没有必要这么高；9.单纯的手铺板，技巧要求很高的，如果有铺板器（也是完全手动的那种），铺出的板子基本上可以保证均一的。10.要喷硫酸乙醇并定量的最好铺水板；铺水板是最考技术的，主要是碾磨技术，大家可以探讨一下；11.硫酸乙醇显色作定量分析的品种，但凡加了CMC-Na的板都易烘糊，尤其是温度高于100度时，后改用不加CMC辅的水板来作，就不会有烘糊现象，故也可推论CMC易于与硫酸起糊化反应。感觉辅水板关键是硅胶G与水的比例要达1：3.5左右，而且研磨后要尽快涂布，不能易于凝固而难于涂布。展开：12.药典：展开容器应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，底部应平整光滑，或有双槽。上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。水平展开用专用的水平展开缸。13.药典：将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜（切勿将样点侵入展开剂中），密封顶盖，待展开至规定距离，除另有规定外，一般为8～15cm，溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，按正文项下的规定检测。14.展开剂的选择（分离单体）：（1）粗分，也就是当你的样品极性范围比较大的时候，可以直接采用极性较小的流动相。然后将前沿、原点以及前沿及原点间的硅胶分别刮下，提取。这样，样品就被分为几个部分，而各个部分的极性相差也比较小了。然后再将这几部分分别进行下面的细分TLC。（2）细分。经过粗分之后，我们一般对各个部分的极性都能够做到心中有数了。比如，被冲到前沿的样品，要采用更小极性强度的流动相，而死吸附部分，则需要较大强度的流动相。我们在初步确定了流动相的极性强度之后，可以自己设计几个溶剂系统。在选择流动相的组成的时候，可以参考snyder的溶剂分类，从质子受体，质子给体和偶极作用的溶剂中各选择一种，然后再选择一个强度调节剂。当然，也可以参考文献中采用的流动相。选好了要用的流动相，就可以根据我们初步确定的极性强度得到流动相的配比了（如果是二元流动相的话）。如果是三元及以上的流动相，可以采用Glajch和Youngstrom的七种溶剂系统的方案进行选择流动相的配比。然后从中选择分离效果比较好的组合。最开始可以采用微量圆环法（将样品点在中间，然后将流动相用毛细管从原点向圆周扩散）和小板实验法来摸索，然后再应用于大的制备TLC。我也曾直接采用圆环法，也称为环形展开，来进行制备的。本来是应该有专门的U形展开室来展开，但是因为我们这里没有这个设备，所以我一般采用简易的方法：即将样品点在中央，然后用尖头的滴管源源不断的向圆心滴加流动相的。样品会分出不同的同心圆而得到分离。这样的好处有三：（1）只要操作小心，各个同心圆真的就非常圆，即不会出现线性层析中的边缘效应等。（2）分离效果更好，拖尾现象小于线性层析。（3）由于圆心式展开的Rfc是线性展开的Rf的平方根，要大于线性展开的Rf，所以分的更开。弊端在于将各个组分从板上刮下的时候需更小心才不会使之混杂。15.当展开剂极性差别很大时，特别是极性大的成分所占比例很小时，往往会出现溶剂脱混现象。在这种情况下，展开槽饱和与不饱和差别没有显著性差异，薄层板上往往会出现类似分层的现象，所以只有换展开系统来调整。16.甲醇用量较小，而甲醇又易挥发，容易产生边缘效应，要特别注意展开剂的平衡和层析缸的密封。17.如果经过一次展开后,展开槽内仍剩下足够的展开剂,可以展开第二块板子吗？个人认为最好不要。一般来说为得到较好的分离效果，应先饱和一下，第二次使用如果还要饱和就会造成另一侧残留的展开剂附着在板子上，造成影响。而且有机溶剂一般较易挥发。18.自己手铺的薄层板怎么都没有买来的高效板好用，用过之后也可以用极性大些的展开剂将展开的点，二次展开跑过，这样就可以重复利用了。显色：19.药典：显色装置喷雾显色要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用专用的玻璃器皿或用适宜的玻璃缸代替；蒸气熏蒸显色可用双槽玻璃缸或适宜大小的干燥器代替。20.说关于薄层板加热变黑的问题，其实很容易解决：当喷完显色剂后不用在放烘箱里烘了，可以用电吹风在板子背面吹吹就能显色了。我们实验室里一般都采用此法，简便、快洁．如果一非想使用烘箱烘的话，一定要用带玻璃窗的，当看到显色了就取出，不然不好控制显色时间，时间过长，CMC容易碳化变黑。21.根据我的经验，薄层版变黑与CMC－Na的浓度过大有关，如果你留意的话，你会发现，当显色剂中有浓硫酸时，加热时间稍长就会变黑（其他显色剂是没事的），我老师说这是因为浓硫酸把CMC－Na炭化了，其实[color=blue=这种情况你只要适当降低CMC-Na的浓度就可以了，当然如果不加CMC-Na的话容易把板弄破。22.显色剂R6：称取100mgDC红色19号（染料索引号No45170）溶于150ml二乙醚、70ml95％乙醇和15ml水。此溶液可保存一周。薄层板喷布显色剂R6后，立即在366nm下观察和记录。问题与应用：23.板子会裂口，一则可能是因为硅胶的比例太大，二则可能是，板子要在常温下晾干后，再在烘箱中活化。如果铺完不久就在较高温度下，裂口的几率就比较高的。24.板铺好后，自然凉干最好，一定是要从玻板后看也是干的，注意一定要放平，最好控制空气流动；然后再放到烘箱中活化，这样就不会有裂开的现象了；如果直接铺好后或者只是硅胶表面是干的，放进烘箱都会有裂开的。25.“晾干的板子放在烘箱里怎么全炸裂了，有什么方法可以避免板子炸裂。”你的板没有完全干透，表面看是干了，但是最中间的没有干，所以你直接放入105度的烘箱烘，当然会炸裂了，所以应该先用低温大约40度左右烘30分钟左右，再用105度活化，就可以解决这个问题了。26.板子炸裂也可能是CMC-Na中有絮状沉淀所致。27.但凡加了CMC的板都易烘糊，尤其是温度高于100度时，若改用不加CMC辅的水板来作，就不会有烘糊现象，但不加CMC辅的板又太软，点样时容易点出洞，有个好办法是将CMC的浓度调至0.1%，这样就不易烘黑的。28.系统适用性：如果你是做鉴别的话，薄层的系统适用性主要是做检测限和分离度。如果你是做含量测定，比如说用薄层扫瞄法，应该做线性范围，同板精密度，异板精密度，回收率。CMC-Na溶液的配制：29.药典规定CMC-Na浓度为0.2％～0.5％，实际操作中0.4％～0.5％最为实用；CMC-Na溶液的溶剂应用蒸馏水，以尽量减少污染。30.配制CMC-Na溶液，根据实际经验一般将溶液浓度配成0.3%，需要铺厚板可配成0.5%左右，薄板可配成0.2%即可。CMC-Na溶解最好是自然溶解（浓度不是太高），也可在水浴中加热促溶（用时还是过滤一下好，避免铺出的板子有麻坑）。31.配制CMC-Na溶液时，可以先量取好蒸馏水，再将称量好的CMC-Na均匀撒在水中，用玻璃棒搅拌，如果操作的好的话可以不用加热都能溶解的很好；当溶解完全后，应该抽滤一下，这样铺的板子很均匀，不过滤会因为一些肉眼看不到的不溶物混入，这样铺的板子会出现许多小颗粒；32.第一个关键的地方，你的CMC-Na溶液必须配制的好，放置的也要很好，完全分层之后只能取上清液。上清液要澄清透明，时间太长的CMC-Na可能会发黄，如果有霉菌出现的话，绝对不能使用；33.如果有抽滤装置你可以直接把CMC-Na溶液滤过，就可以不必等它沉淀再取上清液了（嘿嘿，我是急性子），还有两个好处一是节省CMC-Na溶液，二是倒滤过的CMC-Na溶液的时候不必担心会把下层的不溶物倒出来了。34.在CMC-Na的溶解过程中，可以使用可进行加热操作的磁力搅拌器，大概搅拌5小时，应该可得到满意的效果。而且这样就可以使CMC-Na溶解，并且溶液更澄清;CMC-Na后处理，很多人说是过滤，或者抽滤，我觉得可能速度很慢，而且又容易浪费。我的做法是离心，5000rpm离心20min。倒出上清液，（非常清，也同时消除了过滤过程中可能发生的污染）。更难能可贵的是，我可以收集下面没有充分溶解的CMC-Na。继续加到水中，还可以配制。35.配制4%～5%的羧甲基纤维素（CMC）：称取CMC，溶于冷水中，边加热边搅拌，直至成为清澈、透明的溶液。36.有个办法过滤CMC-Na溶液，在布氏漏斗上平铺薄薄一层脱脂棉，千万保证每个小孔都没漏掉哦！用蒸馏水润湿脱脂棉，启动真空泵，抽紧后就可以放心大胆的倒CMC-Na溶液了，保证滤过的溶液澄清透明，而且长时间放置不沉淀。37.CMC溶液的浓度0.3-0.7%比较合适，浓度高了将来显色时如果有加热过程稍不小心板子容易发黑，浓度低了铺出来的板子不结实，轻轻一碰就掉渣，不好保存，而且点样时会很紧张，容易出洞；38.先将CMC-Na溶解完全,可将溶解成所需浓度加热后超声处理,再抽滤,可很快得到上清液39.CMC-Na煮沸大概30分钟或更久的，其实这个过程很慢。千分之3。过滤一下，抽滤最好。要放冷。40.制备CMC-Na时，我的方法是将CMC-Na加入沸腾的水中，慢加快搅，防止成团，完全溶解之后，自然沉降或者是抽滤（建议不用滤纸，太慢了，脱脂棉是个不错的选择）。41.对于CMC-Na溶液的配置，我认为最好提前几日配好，放置再用。配置时可用超声分散，对少量没有立即溶解的，放置后会逐渐消失。42.CMC-Na要用蒸馏水为溶剂，加热溶解后，放冷，最好滤过使用；消泡剂可直接与CMC-Na溶液混合使用；43.如是铺CMC-Na的薄层板，先将CMC-Na溶解完全，可将溶解成所需浓度加热后超声处理，再抽滤，可很快得到上清液。44.关于CMC-Na的配制我觉得还要说一点就是：这个东西也算是一种高分子材料，而高分子材料的溶解必然都会有一个溶胀，溶解的过程，所以配制的时候，应该将称好的CMC-Na少量的撒在水的表面，让其自然沉降，注意要散开平铺，这样能够充分浸润，使其溶胀，之后可以置于水浴锅内加热溶解；当然如果你不是很急着用的话也完全可以，直接用水泡着放那，估计十天半月的也可以用了。45.CMC-Na的溶解需要煮？？？？药检所的老师用一个大缸子装水，按比例加入CMC-Na，让他自然溶涨、溶解，临用前用漏斗，加脱脂棉，滤过即可；46.根据我的经验，薄层版变黑与CMC－Na的浓度过大有关，如果你留意的话，你会发现，当显色剂中有浓硫酸时，加热时间稍长就会变黑（其他显色剂是没事的），我老师说这是因为浓硫酸把CMC－Na炭化了，其实[color=blue=这种情况你只要适当降低CMC-Na的浓度就可以了，当然如果不加CMC-Na的话容易把板弄破；47.CMC-Na溶液煮了以后不能再用冷水兑，否则，几天以后就会变绿，起霉。48.CMC-Na完全溶解后，用布氏漏斗过滤。玻板：49.选择合适的薄层板（如：20×10cm），清洁干净（先用洗手液或洗衣粉清洗，再用自来水冲洗干净，接着用蘸有乙醇的棉花擦拭干净，最后把板吹干或烘干），放置于清洁处，备用。50.玻璃板应该很干净，没有划痕，没有缺口，4个角要“健全”。51