藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤效应研究

藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤效应研究摘要：从海洋生物中寻找高效、低毒副作用的抗肿瘤药物是近年天然药物研究的新领域。随着海洋生物药学研究的不断深入，发现许多海洋生物的活性物质源于其食物。因此对于海洋生物食物链基层藻类的生物活性物质研究，更具有实际的意义。藻蓝蛋白是存在于一些藻体中的光合色素蛋白，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种生物学功能，有重要的开发利用价值。国内外关于藻蓝蛋白的抗肿瘤作用及其机制的研究已有报道，而酶解后的藻蓝蛋白多肽抗肿瘤效应研究国内外报道很少。随着酶工程技术的发展和应用，利用蛋白酶水解藻蓝蛋白获取生物活性肽更具研究开发潜力，围绕藻蓝蛋白及其酶解产物的抗肿瘤活性及机制进行了综述。关键词：藻蓝蛋白；酶解产物；抗肿瘤活性藻胆蛋白是大量出现于红藻、蓝绿藻和隐藻中的捕光色素蛋白，主要包括藻红蛋白(R-PE)、藻蓝蛋白(C-PC)和别藻蓝蛋白(APC)3种。藻胆蛋白在藻类细胞中的主要功能是作为光合作用捕光色素系统，把捕获的光能高效地传递给叶绿素，从而使海藻的光合作用得以发生[1]。藻蓝蛋白(Phycocyanin)是从螺旋藻中提取的藻胆蛋白的一种，其氨基酸组成合理，其中必需氨基酸占氨基酸总量的37.42%。大量的临床研究结果表明[2-9]，藻蓝蛋白具有抗肿瘤、抗辐射、抗疲劳、调节免疫力、清除自由基、促进细胞生长和保护神经等生理作用。因此螺旋藻粉作为功能保健品十分受人欢迎。当其被食用后，经过肠胃道的消化作用，形成一些多肽产物。随着对酶解多肽的深入研究，发现其更具研究潜力。1藻蓝蛋白抗肿瘤活性研究进展1.1藻蓝蛋白体外抗肿瘤实验研究提纯的藻蓝蛋白(C-PC)对体外培养的肿瘤细胞具有明显的抑制作用。章申峰[2]报道较高浓度(40μmol/mL)的C-PC可在体外显著抑制肺腺癌SPC-A1细胞的生长，并具良好的时间剂量关系。细胞核Hoechst染色和DNA片断化检测表明，诱导细胞凋亡是C-PC杀伤肺腺癌SPC-Al细胞的主要途径。王勇等[9]研究藻蓝蛋白对体外培养HeLa细胞的生长抑制作用，发现随藻蓝蛋白剂量的增加，抑制率逐步提高，而采用流式细胞技术检测HeLa细胞，进行周期分析，初步认为这种抑制机制为藻蓝蛋白使HeLa细胞由合成期(S)或分裂期(M)向G1期转变和积聚，细胞DNA合成衰减，即通过阻止DNA的增殖来抑制肿瘤细胞增殖。此外，藻蓝蛋白对对体外培养的人白血病细胞株HL-60、K-562、和U-937细胞均有不同程度的抑制作用，并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用强[9,10]。诱导细胞凋亡的机理包括选择性的抑制COX-2活性、下调Bcl-2途径，以及增强CD59基因表达、激活半胱氨酸蛋白酶家族等。COX-2的选择性抑制剂可明显抑制肿瘤生长和肿瘤血管生成，诱发肿瘤细胞凋亡，而且还能增强化疗药的细胞毒性和肿瘤的放射敏感性。Reddy[8]研究发现，藻蓝蛋白可选择性抑制COX-2活性来诱导肿瘤细胞凋亡，他们用脂多糖(LPS)刺激RAW264.7吞噬细胞，结果表明藻蓝蛋白具有剂量依赖性抑制该细胞株增殖作用。JaguSubhashini[11]用C-PC处理人慢性白血病细胞系(K562)发现：经C-PC处理后细胞抗凋亡的Bcl-2下调，但是促凋亡的Bax上调或没有任何变化，因此Bcl-2/Bax的比率倾向于使细胞凋亡。研究表明，C-PC通过细胞色素c从线粒体释放进入细胞质，PARP的裂解和Bcl-2的下调诱导K562细胞凋亡。李冰等[12]构建得到含有CD59基因的HeLa细胞，以不同剂量的藻蓝蛋白作用于体外培养的HeLa细胞，研究发现藻蓝蛋白具有抗肿瘤效应，其机制可能是藻蓝蛋白作为一种有丝分裂原，可与肿瘤细胞表面的有丝分裂原受体结合，通过受体的交联和蛋白激酶活化从而促进细胞内CD59基因的转录表达，而过量表达的CD59蛋白又和HeLa细胞上的Fas结合，诱导死亡结构域的活化，从而抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。HaizhenWang[13]等发现藻蓝蛋白的β亚基(C-PC/β)具有抗癌作用。他们研究了C-PC/β抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的机制，发现经C-PC/β处理后细胞中caspase-3和caspase-8活性增加。caspase是细胞凋亡的关键酶，在正常细胞内以非活性的酶原形式存在，一旦被凋亡信号激活，caspase即降解细胞内的蛋白质，使细胞不可逆的走向死亡。1.2藻蓝蛋白体内抗肿瘤实验研究藻蓝蛋白体内抗肿瘤作用的研究，主要是通过注射方式来研究其对实验动物的影响，以避免藻蓝蛋白的酶解作用。李冰[5]建立S180荷瘤小鼠动物模型，腹腔注射C-PC，11天后通过QHS、ELISA、MTT等试验从免疫器官、免疫细胞、免疫分子水平上检测C-PC的抗肿瘤免疫效应。结果显示，C-PC（处理）组小鼠瘤块直径及瘤体重量小于对照组，而且T细胞及B细胞活性，体液抗体量显著大于对照，C-PC高剂量组比低剂量组抑制肿瘤细胞生长和提高机体免疫力的作用更明显，从而揭示藻蓝蛋白的体内抗肿瘤作用与机体免疫系统免疫功能的调节有关。1.3光固定化及硒化藻蓝蛋白的抗肿瘤实验研究关燕清等[14,15]通过生物材料的设计，以固定化来提高藻蓝蛋白的活性。固定化的藻蓝蛋白能避免被细胞内吞消耗，保证与细胞表面受体长时间接触，提高了对癌细胞的抑制率。唐玫等[16]通过生物转化获得富硒藻蓝蛋白。富硒藻蓝蛋白在实验剂量范围内离体实验可提高淋巴细胞转化率，在体实验可增强空斑溶血细胞的溶血能力，且作用强于同等剂量的藻蓝蛋白。1.4藻蓝蛋白的化疗增敏作用在肿瘤化疗中，肿瘤细胞对药物的耐受性是临床肿瘤化疗失败的主要原因之一。辛华雯等[17]研究了藻蓝蛋白对氨甲蝶呤和顺铂的体外增敏作用，发现藻蓝蛋白浓度与Hep-2细胞存活率之间存在良好的线性关系(r=-0.935)。浓度为100mg/L的藻蓝蛋白和10mg/L异搏定均没有明显的细胞毒性，但分别与氨甲蝶呤相互作用后，二者均增强氨甲蝶呤的细胞毒性，同时发现异博定的毒副作用远远高于藻蓝蛋白。1.5藻蓝蛋白的光动力学抗肿瘤作用光动力疗法的基础是生物光动力敏化作用，它利用光敏药物（光敏剂）在生物体内的恶性肿瘤组织中的选择性摄取与滞留以及与生物分子的光敏化氧化作用，产生活性氧物质，破坏组织和细胞中的多种生物大分子，最终引起肿瘤细胞死亡，达到治疗目的。现在也已经证实，藻胆蛋白，包括藻红蛋白(R-PE)、藻蓝蛋白(C-PC)和别藻蓝蛋白(APC)均能够在适宜波长光的激发下，产生单线态氧和其他的氧自由基[18]。自Morcos[19]首先提出用C-PC介导光动力反应治疗肿瘤以来，R-PE与C-PC及其亚基均已被证明具有光敏作用[20-22,30]。李冠武[22]研究发现藻红蛋白在特定激光能量下介导的光敏反应对小鼠S180细胞具有很强的杀伤作用，可诱导其凋亡。郭瑞勇[23]等将藻蓝蛋白亚基通过薄膜水合——超声分散法制备成藻蓝蛋白亚基脂质体，实验表明其肿瘤细胞转染特性和光动力学杀伤作用效果良好，药物的最佳作用时间为4h，在0~200μg/mL内，光照剂量为22J/cm2时，随着藻蓝蛋白亚基及其脂质体浓度的增加，对胃癌细胞BGC-823和小鼠肉瘤细胞S180的光敏作用也随之增强；在200μg/mL时对两种细胞生存率分别降低为(45±5.2)%和(36±5.5)%。2藻蓝蛋白酶解产物生理活性研究进展藻蓝蛋白具有抗肿瘤等生理活性，然而其作为大分子量的天然态的蛋白，不可避免的存在稳定性差，易失活等问题，并且，藻蓝蛋白在体内注射时也容易产生过敏反应并造成了给药途径选择的限制。由于天然存在的活性肽在生物中含量低且提取困难，利用蛋白酶水解天然蛋白质而获得生物活性肽是一种行之有效的方法。利用该方法已成功地从海洋蛋白获得降血压肽和抗氧化活性肽[24,25]。近年来也有报道采用蛋白酶解产物而获得抗肿瘤活性肽。如洪鹏志等[26]研究发现：翡翠贻贝肉蛋白酶水解物对昆明小鼠移殖性肿瘤S180的抑制率达到了50.6%，并且还具有增强免疫功能的活性。Picot等[27]将18种鱼蛋白进行酶解，体外试验表明，3种蓝鳕蛋白，3种鳕蛋白，3种比目鱼及1种鲑蛋白酶解产物均显示对2种人乳癌细胞具有显著的抑制生长作用，显示出蛋白酶解物抗肿瘤活性肽的诱人前景。2.1藻蓝蛋白酶解物的抗肿瘤作用2.1.1藻蓝蛋白酶解肽的体外抗肿瘤研究本课题组[28]研究了藻蓝蛋白及其胰蛋白酶酶解产物对人宫颈癌HeLa细胞株的体外生长抑制作用，发现其有明显的剂量效应，当藻蓝蛋白的浓度达到100mg/L时，其抑制率可达29.9%。酶解时间为1h、2h的酶解产物的抗肿瘤活性明显高于酶解前100mg/L的藻蓝蛋白。2.1.2藻蓝蛋白色素肽的光敏抑癌作用研究黄蓓等[29,30]从藻蓝蛋白酶解产物中分离色素肽，检测其对小鼠肉瘤细胞S180及荷瘤小鼠光动力疗法效果，发现藻蓝蛋白色素肽具良好的PDT效果，有可能通过诱发凋亡途径导致细胞死亡，为藻蓝蛋白深加工提供了实验基础。黄蓓[31]研究了藻胆蛋白色素肽与癌光啉光敏作用的比较实验，发现藻胆蛋白酶解产物R-PE的β亚基(R-PE/β)、C-CP1、C-CP3光谱单一、PDT作用效果良好、毒副作用弱且具有一定的荧光活性可作为新一代光敏剂选择的对象。2.2藻蓝蛋白酶解肽的其它生理活性研究钟耀广[32]通过对螺旋藻蛋白质进行酶解，使其更容易被人体吸收，提高利用率，而且适当的酶解可以减少藻类特有的腥味。张莹[33]通过胰蛋白酶酶解螺旋藻藻蓝蛋白粗提液，显著提高了酶解产物的自由基清除能力及降血压活性，提高了螺旋藻干藻粉的应用价值。3结语癌症是严重威胁人类健康和生命杀手，新药的开发已成为各国研究工作者的研究热点。目前虽然一些癌症的治疗效果已经有了满意的疗效，但对一些癌症，如实体瘤的治疗不尽人意，治愈癌症仍是人类有待攻克的难题。藻蓝蛋白本身具有很多的生物活性，安全无毒，特别适用于癌症等疾病的防治及辅助治疗。藻蓝蛋白酶解产物不仅保留了其原来的抗肿瘤活性等生物学功能，而且还增强了其作用效果，对其深入研究，为使其成为安全高效的新型抗肿瘤药物提供了更充分的依据。参考文献：[1]王广策,邓田,曾呈奎.藻胆蛋白的研究概况(Ⅰ)*——藻胆蛋白的种类与组成[J].海洋科学,2000,24(2):22-25.[2]张申峰.藻蓝蛋白及其亚基的分离纯化和体外抗肿瘤研究[D].杭州:浙江大学,2005.[3]AmhaBelay,YoshimiShiota,KazuyukiMiyakawa,etal.CurrentknowledgeonpotentialhealthbenefitsofSpirulina[J].JournalofAppliedPhyeology,1993,5:235-241.[4]陈新美,王晓华.螺旋藻藻蓝蛋白的稳定性及抗癌活性研究[J].氨基酸和生物资源,2006,28(1):59-62.[5]LiB,ZhangXC,GaoMH,etal.EffectsofCD59onantitumoralactivitiesofPhycocyaninfromSpirulinaplatensis[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2005,59(10):551-560.[6]张成武,曾昭琪.钝顶螺旋藻多糖和藻蓝蛋白对小鼠急性放射病的防护作用[J].营养学报,1996,18(3):327-330.[7]Roy,KarnatiR,ArunasreeKalleM,ReddyNishantP,etal.AlterationofmitochondrialmembranepotentialbySpirulinaplatensisC-phycocyanininducesapoptosisinthedoxorubicin-resistanthumanhepatocellular-carcinomacelllineHepG2[J].BiotechnolApplBiochem,2007,47(3):159-167.[8]ReddyMC,SubhashiniJ,MahipalSV,eta