虎纹蛙骨髓细胞染色体标本的制备及其染色体核型分析

虎纹蛙骨髓细胞染色体标本的制备及其染色体核型分析摘要：骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，所以可以直接观察到分裂细胞。虎纹蛙分布在中国南方，骨髓细胞分裂旺盛。用秋水仙素处理后，可用于染色体标本的制备，也是染色体核型分析的好材料。染色体核型分析是根据染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体的有无等特征，并借助染色体分带技术对某一生物的染色体进行分析、比较、排序和编号。实验数据得到：第4、9对染色体为亚中部着丝粒染色体（sm），其余为中部着丝粒染色体（m），没有亚端部着丝粒染色体（st），没有端部着丝粒染色体（t）。虎纹蛙染色体核型为K（2n=26）=22m+4sm。通过对虎纹蛙骨髓细胞染色体标本的制备和核型分析可知，虎纹蛙的染色体条数为2n=26。关键词：染色体标本；核型分析；虎纹蛙；Photoshop软件引言：虎纹蛙是动物实验教学和研究的常用材料。虎纹蛙骨髓细胞具有染色体大，染色体数目少等优点。染色体核型分析（karyotypeanalysis）是将待测的细胞的染色体按照该生物固有的染色体形态特征和规定，进行配对、编号和分组，并进行形态分析的过程。一般将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。用PHOTOSHOP软件进行分析。核型研究是人类医学遗传研究及临床应用，对探讨动物起源、物种种间亲缘关系鉴定和远缘杂交等方面都有重大意义。1材料与方法1.1材料虎纹蛙（中山大学细胞生物学实验室提供）1.2试剂Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），0.1%秋水仙素溶液，0.65%生理盐水，1/15mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4），Giemsa染液。1.3方法（1）实验前3~4h，按虎纹蛙每克体重2~4ug的剂量，腹腔注射秋水仙素。（2）处死虎纹蛙后，立即取出股骨，用刀剔掉肌肉。（3）用刀片切开股骨的两端，用盛有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白位置。将收集的骨髓细胞平衡后放入离心机，以1000r/min离心10min。（4）离心后，弃上清液，加入6ml蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，低渗20min。（5）加入5滴新配的固定液，立即打匀，并以1000r/min离心10min后，弃上清液。（6）沿管壁慢慢加入6ml固定液，立即用吹管吹打成细胞悬浮液，室温下固定20min。1000r/min离心10min后弃上清液。（7）重复步骤6的操作。（8）沉淀物中加入0.3~0.5ml固定液，用吸管吹打成细胞悬液。（9）用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2~3滴细胞悬浮液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥。（10）将晾干的玻片放在洁净的玻板上，用Giemsa染液染色30min，自来水冲洗，空气干燥。（11）在显微镜下用低倍镜找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察。并拍照。（12）用Photoshop对照片中的染色体进行剪切、分离、配对。先目测配对。（13）用Photoshop的测量工具，测量每条染色体短臂和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数，并记录原始数据。（14）根据测量数据校正目测配对排列的结果，进行调整排列。（15）把染色体按照一定顺序一对一地排列，按照从大到小，短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列的规则排列，最后整成一张完整的染色体核型图。2实验结果实验所得的虎纹蛙染色体标本，在显微镜中显示染色体条数为2n=26下图为实验所得的虎纹蛙镜检照片图1实验所得虎纹蛙镜检照片实验所得的标本在显微镜下弯曲，轻微折叠。所以采用化生班郑雨涵同学的染色体图。用PHTOTOSHOP处理后，排列得到张染色体核型分析图：图3虎纹蛙染色体核型分析图然后继续用PHOTOSHOP软件处理，测量每条染色体的长臂与短臂，并做出数据分析。分析表如下：染色体对数长臂短臂染色体长度相对长度（％）臂指数着丝粒指数（％）着丝粒位置138367314.901.0349.31m238.52563.512.961.5439.37m338236112.451.6537.70m43420.554.511.121.6637.5sm52319428.571.2145.23m61913326.531.4640.625m71711285.711.5539.28m81613295.911.2344.83m9158234.691.8834.78sm10156214.292.528.57m11139224.491.4440.91m12129214.291.3342.86m13128204.081.540m结果分析：1、从上图数据可知：第4、9对染色体为亚中部着丝粒染色体（sm），其余为中部着丝粒染色体（m），没有亚端部着丝粒染色体（st），没有端部着丝粒染色体（t）。虎纹蛙染色体核型为K（2n=26）=22m+4sm。2、第7对染色体长臂出现了明显的次缢痕。这是虎纹蛙的一个染色体特征。但是没有发现端粒、随体等。3、可推测第相对长度最短的第13对染色体为性染色体，且因两个染色体形状、大小相近，应为XX，与该青蛙为雌性的事实相符，但因为本实验并没有做成年雄性青蛙的对照实验，因此无法确定此结论。讨论1、数蛙属两栖类的染色体组型中，染色体数都为26即13对，包括5对大型染色体及8对小型染色体，本实验的结果显示符合这一典型标准。2、制作染色体标本过程中，低渗处理是实验成败的关键，其目的在于使细胞处于低渗溶液中从而涨大，染色体松散。处理时间太长会使细胞破裂，染色体过度分散或丢失。3、秋水仙素的浓度和处理时间都对实验结果有很大影响。浓度过高，处理实验过长，都会使染色体过分收缩，不利于形态观察；浓度过低，处理时间过短，则收集到的中期分裂相少。4、经典的核型分析方法是用显微摄像机将核型拍摄，洗出照片后用剪刀将各染色体剪下，然后分组、排序、粘贴、复拍，最后才制成核型分析的照片进行进一步的研究，方法繁琐且易出错。本实验采用photoshop抠图，测量，提高了准确度，但还是因为认为操作而造成误差。另外，由于一些染色体比相对较短，因此测量时的相对误差也较大参考文献[1]王金发、何炎明.细胞生物学实验教程.北京：科学出版社，2004.9:83-85，91-93.[2]王金发.细胞生物学.2003,北京：科学出版社[3]邹佩贞.广东韶关地区虎纹蛙、黑斑蛙染色体核型分析.安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2008,36(31):13516-13518.[4]杨大翔.用AdobePhotoshop进行核型分析.5农业网络信息62005年第3期应用实践：44-46.Themarrowcellchromosomepreparationandkaryotypeanalysisoffrog(12Chemistry,SunYat-Senuniversity,Guangzhou,510275)Abstract:Specificityofthespeciesinthekaryotypethatkeepsrelativelystableintheprocessofinheritanceisatypicalcharacteristictoidentifykindsofspecies.Theexperimentusefrogtobethestudymaterial.ThentherelativelengthofeverypairoftheChromosomeismeasuredbyphotoshopandrecordedtonameandgroupthemaccordingtotheirbrachialindexesandcentromereindexesreferringtotheLevan’smethod.TheresultsshowedthatthekaryotypeoftigerfrogwasK(2n=26)=12mKeywords:chromosomepreparation；karyotypeanalysis；Ranatigrina；Photoshop