蛋白SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定

蛋白SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定一、原理：（1）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS-PAGE。用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量（relativemolecularmass,Mr）测定。SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denaturedprotein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。（2）分离效应：PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuouselectrophoresis）：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuouselectrophoresis）：采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系连续PAGE：电荷效应；分子筛效应不连续PAGE：电荷效应；分子筛效应；浓缩效应不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。①浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。②电荷效应：分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。③分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。SDS-PAGE线性分离范围丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD）1512—431016—687.536—94557—212二、实验材料和试剂器材：（1）夹心式垂直板电泳槽，凝胶模（135×100×1.5mm）（北京六一仪器厂）（2）直流稳压电源（电压300-600V，电流50-100mA）（3）吸量管（1、5、10ml）；（4）烧杯（25、50、100ml）；（5）细长头的滴管（6）1ml注射器及6号长针头；（7）微量注射器（10μl或50μl）试剂：标准蛋白质：不连续体系SDS-PAGE有关试剂（1）10%（W/V）SDS溶液：称5gSDS，加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。（2）1%TEMED（V/V）：取1mlTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。（3）10%AP（W/V）：称AP1g，加重蒸水至10ml。最好临用前配制。（4）样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液。①先配制0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称Tris0.6g，加入50ml重蒸水，再加入约3ml1mol/LHCl，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。②按下表配制样品溶解液：表：不连续体系样品溶解液配制*如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。SDS巯基乙醇溴酚蓝蔗糖0.05mol/LTris-HCl加重蒸水至最后总体积为100mg0.1ml2mg4g2ml10ml（5）凝胶贮液①30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称Acr30g及Bis0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。②10%浓缩胶贮液：称Acr10g及Bis0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。（6）凝胶缓冲液①分离胶缓冲液（3.0mol/LpH8.9Tris-HCl缓冲液）：称Tris36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol/LHCl约48ml，调pH至8.9，最后加重蒸水定容至100ml，4℃贮存。②浓缩胶缓冲液（0.5mol/LpH6.7Tris-HCl缓冲液）：称Tris6.0g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol/LHCl约48ml调pH至6.7。最后用重蒸水定容至100ml，4℃贮存。（7）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。（8）1%琼脂（糖）溶液：称琼脂（糖）1g，加电极缓冲液100ml，加热使其溶解，4℃贮存，备用。固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。染色液：称考马斯亮蓝R2500.125g，加上述固定液250ml，过滤后应用。脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。三、实验步骤：（SDS-PAGE）1.母液配制2.制胶准备：（1）玻璃板清洗、干燥；（2）制胶架的准备：严格按说明书组装制胶架注意：轻拿轻放文明操作，避免玻璃板破损制胶架松动及其他设施偏离工作要求。3.制胶：分离胶、浓缩胶：根据待分离样品的分子大小选择15%的分离胶，如表配制浓缩胶（5ml）双蒸水0.5mol/LpH6.8Tris-HCl30%胶贮液10%SDSTEMED10%AP5%3.4ml0.63ml0.83ml50μl5μl50μl分离胶（10ml）双蒸水1.5mol/LpH8.8Tris-HCl胶贮液10%SDSTEMED10%AP15%3.3ml2.5ml4ml100μl4μl100μl15%2.8ml2.0ml5ml100μl4μl100μl4.按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。5.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置10分钟。样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。6.电泳液缓冲（*10）配制：30gTris,150gGly,10gSDS+800mldH2O,定容至1000ml7.样品处理：取30ul样品（S1，S2），加入30ul上样缓冲液，100℃水浴30min，拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。8.加样3个，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白Marker。其中蛋清（S1）和Marker加样量为2µl，S1、S2、S3、和S4加样量为10µl。为了练习和比较上样量的影响，可以加20µl的S1~S2作为对照。注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。9.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在160V，当进入分离胶后改为240V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。10.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液，42℃染色40min左右。剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。11.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。12.将凝胶照相并进行分子量分析、测定。将凝胶至于薄板上（水润避免破损），并至于白色背景上，用直尺量取marker中各条带距离分离胶前沿的距离，以对应的分子量绘制分子量标准曲线：logMW=K-bX以量取溶菌酶的迁移距离带入公式中计算分子量电泳胶实例：