蛋白纯化思路

1上清纯化挂柱不挂柱纯不纯标签不正常标签正常无标签量够量不够再次挂柱换纯化方式换纯化方式换纯化方式换纯化方式终止终止终止2包涵体纯化溶解（8M尿素）不溶解（8M尿素）挂柱不挂柱溶解（6M盐酸胍）不溶解（6M盐酸胍）纯不纯标签不正常标签正常无标签不溶解（SDS）溶解（SDS）量够量不够再次挂柱换纯化方式换纯化方式换纯化方式换纯化方式复性复性再次纯化纯不纯纯不纯纯不纯纯不纯纯不纯终止正常不正常量够换纯化方式再换纯化方式再换再换再换纯化纯化纯化透析透析纯不纯方法方法方法正常不正常终止纯不纯纯不纯纯不纯终止终止终止3上清纯化(1)上清纯化：挂柱和不挂柱。(2)当蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度和量达标时，可进行透析试验。透析试验正常（浓度达标），可进行分装；透析试验不正常（浓度不达标），要么浓缩（离心或甘油），要么重新取样将蛋白浓度控制高一点；透析试验不正常（出现沉淀），要检查透析时的浓度，透析Buffer，PH值是否正常，不正确要改正，并结合参考文献和客户的要求，以确定最终的透析条件。(3)当蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度达标时，但是量不够时，可重新接大瓶后再次纯化以达到所需的量。与此同时可将先纯化得到的不足量的蛋白去做透析小试，以便为此后的足量蛋白透析摸索条件。(4)当蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度不达标时，先判断是否是洗脱时洗脱Buffer的梯度选择有问题，或者是梯度没有洗脱彻底。如果是上述原因，可将样品再次挂柱，选择最佳洗脱梯度并洗脱彻底。或者将不纯的样品挂离子柱，若纯度达标则进行下一步操作，若纯度还不行，可将不纯的样品过分子筛，若多种纯化方式结合后纯度依然不达标，要么与客户沟通，要么终止实验。(5)当蛋白不挂柱时，目标蛋白带标签的要考虑一下标签是否正常。通过Westernblot等方法检测标签是否正常，如果标签正常，有可能是蛋白的标签没有暴露，可以加入足量的还原剂等使其标签暴露，也可以通过挂离子柱和过分子筛来纯化蛋白；如果标签不正常，有可能是在样品处理时将其所带的标签断裂，其与不带标签的蛋白处理方4法一样，通过挂离子柱和过分子筛来纯化蛋白；以上的方法纯化的蛋白纯度达标可进行下一步，若已经通过组合纯化的方式纯度不达标，要么与客户沟通，要么终止实验。(6)在纯化上清时，会经常出现蛋白不稳定（降解或沉淀）的情况，所以在处理样品时就可以另外加入1—2mMDTT，或者在收集时在洗脱Buffer中加入1—2mMDTT。并且纯化时的速度要快，且全程必须在冰浴中进行。5包涵体纯化（1）包涵体纯化：溶解（8M尿素）和不溶解（8M尿素）；溶解（6M盐酸胍）和不溶解（6M盐酸胍）溶解（1%—2%SDS）和不溶解（1%—2%SDS）挂柱和不挂柱（2）当8M尿素溶解好的蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度和量达标时，可进行复性透析试验。复性透析试验正常（浓度达标），可进行分装；复性透析试验不正常（浓度不达标），要么浓缩（离心或甘油），要么重新取样将蛋白浓度控制高一点；复性透析试验不正常（出现沉淀），要检查透析时的浓度，复性透析Buffer，PH值是否正常，是否加入肌氨酸钠等，不正确要改正，并结合参考文献和客户的要求，以确定最终的复性透析条件。（3）当8M尿素溶解好的蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度达标时，但是量不够时，可重新接大瓶后再次纯化以达到所需的量。与此同时可将先纯化得到的不足量的蛋白去做复性透析小试，以便为此后的足量蛋白复性透析摸索条件。（4）当8M尿素溶解好的蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度不达标时，先判断是否是洗脱时洗脱Buffer的梯度选择有问题，或者是梯度没有洗脱彻底。如果是上述原因，可将样品再次挂柱，选择最佳洗脱梯度并洗脱彻底。或者将不纯的样品挂离子柱，若纯度达标则进行下一步操作，若纯度还不行，可将不纯的样品过分子筛，若多种纯化6方式结合后纯度依然不达标，要么与客户沟通，要么终止实验。（5）当8M尿素溶解好的蛋白不挂柱时，目标蛋白带标签的要考虑一下标签是否正常。通过Westernblot等方法检测标签是否正常，如果标签正常，有可能是蛋白的标签没有暴露，可以加入足量的还原剂等使其标签暴露，也可以通过挂离子柱和过分子筛来纯化蛋白；如果标签不正常，有可能是在样品处理时将其所带的标签断裂，其与不带标签的蛋白处理方法一样，通过挂离子柱和过分子筛来纯化蛋白；以上的方法纯化的蛋白纯度达标可进行下一步，若已经通过组合纯化的方式纯度不达标，要么与客户沟通，要么终止实验。（6）当8M尿素不溶解蛋白（溶解率低），首先分析是否是在处理样品时没有研磨充分，如果研磨不充分，会导致蛋白胶质化，难以溶解。如果研磨充分，还是不溶解，就该用溶解性更高的6M盐酸胍溶解。（7）如果6M盐酸胍溶解蛋白充分，下面的步骤和8M尿素充分溶解蛋白的步骤一样。（8）当6M盐酸胍不溶解蛋白（溶解率低），若是操作原因可改正，若不是操作原因，需要用溶解性能更高的1%—2%SDS溶解。（9）如果1%—2%SDS溶解蛋白充分，下面的步骤和8M尿素充分溶解蛋白的步骤一样。（10）如果1%—2%SDS不溶解蛋白（溶解率低），若能从低溶解率的蛋白溶液中纯化得到，可进行下一步；若纯化不达到，要么与客户沟通，要么终止实验。(7)在纯化包涵体时，会经常出现蛋白不稳定（降解）的情况，所以7在处理样品时就可以另外加入1—2mMDTT，或者在收集时在洗脱Buffer中加入1—2mMDTT。并且纯化时的速度要快。