蛋白荧光染料大比拼

蛋白荧光染料大比拼要：随着蛋白质组学的发展，定量蛋白质组和多重分析越来越流行，考马斯蓝染色及银染已经无法满足更高的要求。此时，荧光染料的优势就凸显出来。生物通这就带大家看看市场上主流的蛋白荧光染料，包括总蛋白染料、磷酸化蛋白和糖基化蛋白染料。另外，本文还会介绍一些特殊用途的荧光染料。几十年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）及相关的blot已经成为蛋白分析的主流技术。考马斯蓝染色和银染也就成了我们最熟悉的染色方法。不过，随着蛋白质组学的发展，定量蛋白质组和多重分析越来越流行，这些染料已经无法满足更高的要求。此时，荧光染料的优势就凸显出来。生物通这就带大家看看市场上主流的蛋白荧光染料，包括总蛋白染料、磷酸化蛋白和糖基化蛋白染料。另外，本文还会介绍一些特殊用途的荧光染料。总蛋白染料与传统的考马斯蓝染色相比，荧光染色可将检测的灵敏度降至1ng以下，与银染相当；而与银染相比，荧光蛋白染料的线性范围比银染宽很多，一般可达3个数量级以上，且对不同种蛋白的染色强度变化小，与蛋白质量成清晰的线性关系，而不依赖于多肽序列及糖基化程度。目前的荧光染色法与后续的质谱分析和Edman测序等技术兼容，因此无论在1D还是2D电泳领域都日渐受到研究人员的青睐。蛋白荧光染料需要一个紫外光透射仪（下紫外）才能观察，当然，有激光扫描仪时效果更佳。名气最大的总蛋白荧光染料当属Invitrogen旗下MolecularProbes公司持有专利的SYPRO®荧光蛋白染料系列。这一最早上市的荧光蛋白染料系列包括了SYPRO®Ruby，SYPRO®Red，SYPRO®Tangerine几种不同颜色。其中紫红色的SYPRO®Ruby最为著名，也有人翻译成SYPRO红宝石。它的检测极限为0.25-1ng，线性范围超过3个数量级。它与碱性氨基酸和多肽主链结合，因此不同蛋白之间的差异性小，可进行更为准确的定量。它的染色范围包括糖蛋白、磷酸化蛋白、脂蛋白、钙结合蛋白及其它难染色的蛋白，不会过度染色，也不干扰后续的质谱分析和Edman测序等技术。操作起来也很简单，固定两次，染色过夜，脱色就OK了。如果你想快一点看到结果，可以用微波炉来快速染色，时间只需要1个半小时。SYPRORuby是即用型的1×染料，使用方便，当然价格也不便宜。SYPRORuby有两个激发峰-280nm和450nm，发射峰为～610nm。紫外透射仪、蓝光透射仪或激光扫描仪都可以观察染色后的蛋白。简单而快速的SYPRORed和SYPROTangerine通常用于1D电泳的凝胶染色。产品如其名，一种是鲜艳的正红色，一种是明亮的金橘色。以Lonza公司（即原来FMC王牌琼脂糖的电泳系列，卖给Cambrex后又被合并到Lonza旗下）的产品为例，取适量5000x浓度的原液稀释为1x浓度，遮光浸泡凝胶40-60分钟后即可上紫外透照仪，CCD或者激光扫描仪进行检测，无需额外的固定步骤，检测下限可低至每条带1ng蛋白。稀释液在遮光4°条件下可以稳定保存至少3个月。SYPROTangerine尤为值得推荐。这种荧光蛋白染料在整个使用过程中无须用到酸或者有机溶剂，染色可在saline或者PBS或Tris-HCL等多个体系的缓冲液中进行，不与蛋白共价结合也不影响抗体结合，无需洗脱即可直接转膜进行WesternBlotting，兼容后继的酶法分析或者WesternBlotting，特别适用于非变性胶的活性蛋白检测。SYPRORed则需要用乙酸溶液稀释。这两种染料在长时间UV光照下会发生光漂白，这时只要重新染色即可。这两种染料价格差不多，500ul的5000x原液价格在2000多人民币。Bio-Rad公司的总蛋白染料有个很好听的名字，火烈鸟-FlamingoFluorescentGelStain。它的线性范围也超过3个数量级，灵敏度似乎比SYPRORuby更高，在激光扫描模式下它的检测极限能达到30pg。染色所需时间为5小时，且着色深浅对染色时间不敏感，无需脱色。Bio-Rad没有提供快速染色的protocol，虽然手工操作的时间很少，但5小时还是略嫌稍长。染过的凝胶在2-8℃下可保存6个月而无明显褪色。Flamingo染料的最大激发峰和发射峰分别为512nm和535nm，不过在271nm有第二激发峰，也可用紫外光激发。Pierce（现属于赛默飞世尔科技）的KryptonProteinStain名字虽不起眼，也是市场上很受欢迎的一款蛋白染料。就检测灵敏度和线性范围而言，它与前两款不分伯仲。它的一个明显优势就是染色时间较短，虽说步骤有些繁琐，但整个过程只需要2小时40分钟。另外，它也提供了快速染色的步骤，只要半个小时就能看到结果了，当然，时间快了灵敏度也会打折扣。KryptonProteinStain的性价比很高，在这三种荧光染料中，它是最便宜的。它与Flamingo都是10×的浓缩液，使用前需要用水稀释。另外，PIERCE还专门为红外激光成像开发了一款总蛋白染料KryptonInfraredProteinStain。它的灵敏度、检测时间都与KryptonProteinStain相似，不过激发和发射波长更大，在690和718nm，适合于LI-COR的Odyssey及其它红外成像系统。三款主流总蛋白荧光染料的参数对比产品名称SYPRORubyProteinGelStainFlamingoFluorescentGelStainKryptonProteinStain制造商Invitrogen索取资料Bio-Rad索取资料Pierce（ThermoFisherScientific）索取资料检测极限0.25-1ng0.25-0.5ng≦0.25ng线性范围3个数量级3个数量级3-4个数量级染色步骤（标准）1.在甲醇、乙酸中固定1小时2.过夜染色3.在甲醇、乙酸中洗涤30分钟1.在甲醇、乙酸中固定2小时2.染色至少3小时3.在吐温20中洗涤30分钟1.在甲醇、乙酸中固定1小时2.水洗5分钟3.染色1小时以上4.在乙酸中脱色5分钟5.水洗30分钟耗时（标准）～18小时5小时2.7小时耗时（快速）1.5小时无0.5小时质谱兼容是是是规格*1L（1×）100ml（10×）100ml（10×）参考价格3347.002000.001695.00*还有其他规格，请向当地经销商或厂家咨询。除了最常见的凝胶染色，SYPRO®Ruby还可用于等电聚焦IEF，且只需进行一次20分钟的固定（1D不用固定，但等电点聚焦IEF则需要固定3小时），染色3个小时（IEF需要染过夜），脱色30分钟后即可观察。Lonza这个产品1L的即用型原液价格要3000左右。值得注意的是SYPRO®Ruby在整个使用过程都要遮光，且应用聚丙烯类塑料盘染色，避免使用玻璃。SYPRO®Ruby染色结果经过2%甘油浸泡后可以进行干胶永久保存，只是极低浓度的条带就可能看不到了。另外还有个小秘密，Lonza的说明书里提及由于甲醇和乙酸混合可能产生乙酸乙酯，对后继的质谱可能有影响，后面考虑做质谱的同学或许需要考虑用其他替代。另外，Invitrogen还有一种SYPRORubyproteinblotstain，是专门染膜的，作用就像丽春红。但它的优点是不与蛋白共价结合，也就不影响后续的鉴定过程，因此可用于免疫染色之前，来定位分子量标准或看看样品的总蛋白图谱，这样就免去了平行跑两块胶的麻烦，轻松比较总蛋白和目的蛋白。它还与后续的测序和质谱分析兼容。只需染色15分钟，SYPRORubyproteinblotstain就能检测PVDF或NC膜上的2-8ng/条带。膜染料还有一种，名字也相当好听，SYPRORosePlusProteinBlotStain，灵敏度与Ruby不相上下，不过染色是可逆的。通过膜的洗涤，染料很容易就被完全剥离，这就很适合于临时的检测，比如蛋白芯片中的质量控制。这两个膜染料的价位都在两千出头，可用于1600cm2的印迹膜。2DDIGE说到荧光，又谈到2D，那怎么能忘了正流行的2DDIGE呢。荧光差异凝胶电泳技术是在传统双向电泳技术的基础上结合了多重荧光分析的方法，可在同一块胶上同时分离多个分别由不同荧光标记的样品。由于不同的荧光标记样品有不同的激发波长，可通过不同的滤光片记录互不干扰的胶图结果。由于有了多色荧光标记，使得在同一块胶中分离并分析多个样本成为可能。这样有效避免了不同胶间的系统误差，特别适合比较不同样本间差异。荧光染料种类虽多，但用于蛋白质组样品标记的荧光染料不同于普通荧光染料，标记后的蛋白质不应该有等电点上的改变，分子量上的改变也应该保持最小，而且不同荧光染料导致的分子量的改变应该一致。用于蛋白质预先标记的荧光染料分为两类，最小标记和饱和标记。其中最小标记荧光染料包括三种，分别是Cy2，Cy3和Cy5。这三种荧光染料化学结构上相似，分子量接近，带有相同的活化基团－NHS脂，可以特异性的标记在赖氨酸残基的ε氨基上，由于三种染料均带有一个正电荷，这样通过取代反应蛋白质的等电点不会发生改变，保证了不同样品中的相同蛋白质可以泳动到相同的位置。不过要注意，过多的染料标记会导致蛋白质的疏水性增加而不易溶解。保持1～2%的蛋白质的赖氨酸残基被荧光标记修饰，才可以维持被标记的蛋白在电泳时的溶解性，因此，在标记样品时，保证合适的蛋白质和染料的摩尔数比例至关重要。通过调整合适的pH值、合适的染料和蛋白质的摩尔比，可以保证每个蛋白质分子最多只标记上一个染料分子，来保证蛋白质的分子量变化最小。饱和标记的荧光染料包括两种，标记蛋白质上的半胱氨酸残基，主要用于一些来源和珍贵的微量样品的研究中。饱和标记可避免上述问题，但是使用成本较高。在采用饱和标记分析蛋白质组样品时，必须先进行染料量的滴定，以确定合适的还原剂和染料的加量，否则，在DIGE胶图上很轻易造成水平链状的点或垂直拖尾。另外，由于被标记了的蛋白质的分子量发生了改变，饱和标记的胶图和银染的胶图有所不同。DIGE中的学问相当大，简单几段话可说不清楚，如果有同学想了解更多，可以读读这一篇《定量蛋白质组学研究中的荧光差异凝胶电泳技术》。磷酸化蛋白上面提到的是总蛋白染料，它可不分蛋白类型，只要是蛋白，就通通不放过。有时，你的目标仅仅是磷酸化蛋白，那么需要特异的磷酸化蛋白染料。2003年，MolecularProbes公司的WaynePatton等在JBC上报道了一种全新的荧光染料Pro-QDiamond，它可对磷酸化基团（连接在酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上）特异性染色。该方法方便、快捷且具有较高的灵敏性，线性范围超过3个数量级，与质谱鉴定兼容。之后他们又将一些蛋白质和肽段点样在蛋白芯片上，然后利用Pro-QDiamond来检验芯片上的蛋白质及多肽的磷酸化水平，灵敏度可达到312-625fg，这种芯片与染料的结合为研究信号通路及磷酸酶抑制物提供了一个很好的平台。Pro-QDiamond染料还可与SYPRORuby共同使用，来检测总蛋白中的磷酸化蛋白。糖基化蛋白对于糖基化蛋白，MolecularProbes则提供了Pro-QEmerald300和488糖蛋白染料。Pro-QEmerald300能与高碘酸盐氧化的碳水化合物基团相互作用，让糖基化蛋白产生明亮的绿色荧光。这种方法能检测低至0.5ng的糖蛋白，比酸性品红染料灵敏50倍。Pro-QEmerald300的激发和发射波长分别为280nm和530nm，可用紫外透射仪观察。它也能与SYPRORuby共用，来检测糖基化情况。另外，Pro-QEmerald系列还有另一个成员-Pro-QEmerald488，激发波长在510nm，也是发绿色荧光。它的灵敏度比前者稍逊，为4ng。它们俩都与质谱分析兼容。PIERCE也有一款糖基化蛋白的染料KryptonGlycoproteinStainingKit，能够检测1-D和2-D胶中的糖基化蛋白。与Pro-QEmerald300相比，它的灵敏度不算出众，仅为15ng。优势也是速度快，对于一般的迷你胶，染色过程4个小时，如果是那种很大的2-D胶，4.5小时也可完成。它